尼莫司汀缓释微球对C6胶质瘤细胞的毒性作用

　　作者：章文斌,刘宏毅,马晓东,周定标　　作者单位：210029南京医科大学附属脑科医院神经外科(章文斌，刘宏毅);中国人民解放军总医院神经外科(马晓东，周定标)

　 【摘要】目的 考察BCNU PLGA缓释微球浸出液对肿瘤细胞的毒性作用。方法 以含不同载药量及不同释放时间(4h、1、2、3、7、14 d)的BCNU PLGA MS浸提液作用于培养的C6胶质瘤细胞，以流式细胞仪检测细胞的凋亡和细胞周期的变化。并观察凋亡细胞的电镜形态学变化。 结果 缓释微球可以引起明显的细胞坏死和凋亡，不同载药量缓释微球引起的细胞死亡率由(5.35±1.99)%上升到(20.15±2.96)%，晚期凋亡率由(4.25±1.11)%上升到(32.33±2.62)%，细胞早期凋亡率由(6.44±0.57)%上升到(21.82±3.04)%，G0G1期细胞上升，S期细胞比例降低，增殖指数呈现降低的趋势。电镜下可见典型的凋亡形态特征。结论 BCNU PLGA缓释微球可以抑制C6胶质瘤细胞的增殖，随释放时间延长细胞生长抑制率逐渐上升。

　　【关键词】 尼莫司汀;缓释;C6胶质瘤细胞

　　Cytotoxicity effects of BCNU loaded PLGA wafer against C6 tumor cell ZHANG Wen bin, LIU Hong Yi, MA Xiao dong,et al. Department of Neurosurgery, Brain Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Nanjing 210029,China

　　Abstract: Objective To explore the cytotoxicity effects of BCNU loaded PLGA wafer against C6 glioma cell. Methods BCNU loaded PLGA wafer with different dosage were putting into cell culture medium and then measured by flow cytometry to study necrosis and apoptosis of tumor cells. Results Mortality rate increased from (5.35±1.99)% to (20.15±2.96)%,advanced stage apoptosisrate elevated from (4.25±1.11)% to (32.33±2.62)% and early apoptosis rate from (6.44±0.57)% to (21.82±3.04)%. Cell cycle also changed after exposure to the wafer.Cells in G0G1 phase increased and in S hase decreased. Proliferation index present the tendency of depression. Observation of glioma cell morphology after exposure to BCNU loaded PLGA sustained release polymer showed that the cell quantity depletion and apoptosis in some of them which aggregated together with deflated volume and compacted nucleus. Typical apoptosis character can be observed under transmission electron microscope.Conclusion BCNU loaded PLGA wafer can inhibit the proliferation of C6 glioma cell and demonstrate gradually increased tendency with prolonged release time.

　　Key words: BCNU; sustained release;C6 glioma cell

　　尼莫司汀(BCNU)是临床上脑胶质瘤化疗的主要药物，但由于血浆半衰期短及药物的毒副作用，限制了临床应用。我们自制了尼莫司汀 聚乳酸羟基乙酸缓释微球(BCNU PLGA MS)，以期达到瘤内缓释化疗的作用。经体内和体外实验证实该缓释微球有明显的缓释作用，并且在大鼠植入侧半球药物浓度明显高于对侧和血清药物浓度。本实验以自制缓释微球BCNU PLGA MS的浸出液作用于C6胶质瘤细胞，观察微球对胶质瘤细胞凋亡、坏死以及细胞周期的变化，为进一步体内试验做准备。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂 DMEM培养基加10%小牛血清、25 mmol/L Hepes、青霉素1×105u/L、链霉素100 mg/L，pH7.4，小牛血清。胰蛋白酶以Hank’s液配制成2.5 g/L， Annexin Ⅴ FITC/PI双染法流式细胞分析试剂盒，甲基噻唑基四唑(methyl thiagolyl tetragolium，MTT)配制成5 mg/ml的工作液，二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide，DMSO)，动物细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒。

　　1.2 仪器 FACSCalibur型流式细胞仪，CO2细胞培养箱，超净工作台，OlympusIMT 2型倒置显微镜，OlympusIM71型荧光显微镜，LeicaDMLB数码成像显微镜，JEM 1230LV透射电子显微镜，BioRAD 450型酶标仪。

　　1.3 细胞凋亡的诱导 取对数生长期的C6细胞，用培养液将细胞数稀释为106个/ml。在选定的时间点(4 h,1,2,3,7,14 d)取出含药培养基，以等量的BCNU PLGA MS浸提液分别加入对数生长期的C6细胞中，混匀后放入37℃，5%的CO2培养箱继续培养24 h，以不加药的培养C6细胞作阴性对照。

　　1.4 细胞凋亡的检测 取对数期C6胶质瘤细胞，以5×104/ml密度接种于25 cm3培养瓶，每瓶5 ml，分为5%、10%、20%BCNU PLGA MS组及对照组，1 d后根据不同组别换以含不同载药量及不同释放时间(4 h,1,2,3,7,14 d)的BCNU PLGA MS浸提液，细胞培养箱孵育24 h后弃去浸提液，PBS洗2次，细胞刮刀收集细胞，1 500r/ min离心5 min，收集细胞，弃上清后分为两部分，一部分用冰预冷的PBS洗1次，取100 μl转至5 ml流式专用上机管，加入10 μl PI溶液和5 μlAV FITC溶液。混匀细胞，室温暗处孵育15 min后加入400 μl缓冲液，上机进行多参数流式细胞术分析。另一部分以70%冷乙醇固定过夜，用DPAI进行染色，于流式细胞仪进行细胞周期分析，计算增值指数PI(proliferation index)=S+G2M/G0G1+S+G2M。

　　流式细胞术分析采用488 nm激发光源，先将对照管上样，通过调整参数FSC和SSC，在散射光点图(FSC/SSC)中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前，根据FSC/SSC的特点，设定阈值，避免碎片和噪声干扰。确定电压及放大器数值后，对细胞群体进行设门(Gate)，使门中细胞占95%以上，再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将裸细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光，并在此基础上确定阳性荧光表达比率。调定流式细胞仪，使荧光散点图中裸细胞集中分布在左下(LL)象限。保持FL1、FL2不变，分别将单染AV FITC的管和单染PI的管上样，调整仪器荧光补偿值，进行光谱重叠的校正后即可分析样本。每个样本均获取10 000个细胞，数据以listmode形式储存，采用Cell Quest功能软件进行分析。

　　1.5 统计分析 采用SPSS11.0软件，t检验。

　　2 结 果

　　2.1 细胞凋亡的流式细胞仪检查 5%BCNU PLGA MS 作用后流式细胞结果(见表1,2,3,4)。表1 BCNU PLGA MS作用于C6细胞诱导的细胞死亡率表2 BCNU PLGA MS作用于C6细胞诱导的细胞早期凋亡率对照组2.55±0.55，*P=0.05有显著性差异，▲P=0.01有显著性差异。表3 BCNU PLGA MS作用于C6细胞诱导的细胞晚期凋亡率

　　3 讨 论

　　BCNU是细胞周期非特异性的脂溶性药物，应用于脑胶质瘤的化疗已经有较长的历史，疗效确切并可以通过血脑屏障，但常规系统化疗时有严重的剂量依赖的骨髓抑制、肝毒性、肺纤维化等作用[1]。而通过BCNU PLGA MS缓释给药，BCNU从PLGA中逐步释放出来，在局部形成较高的药物浓度，避免了进入血液循环而产生的毒副作用。另外，PLGA呈疏水性，可以有效保护其内部的未释放的药物不被水解，保证有效的持续杀瘤作用。对于胶质瘤来说，持续的低浓度药物暴露要比一次高浓度的药物暴露更重要[2]。本研究制备的BCNU PLGA MS缓释剂在体外的释药速率稳定，第1 d释放出4.34%的药物，1 周时释放43.19%，在第21 d时累积释放出97%的药物，持续释放药物时间达3周;体内释放药物速度快于体外，第1 d释放出16%的药物，1 周时释放77%，在第15 d时释放出97%的药物，足以满足缓释的要求。而且BCNU PLGA MS缓释剂在脑内的药物浓度在191 1869 μg/mg脑组织，时间达到2周，是血清及对侧脑组织浓度的数倍到数十倍，显示BCNU PLGA MS缓释系统较好的缓释性能和高效低毒的特点。

　　新近的研究还发现BCNU具有诱导细胞凋亡的作用[3]，同时BCNU还是细胞凋亡蛋白酶(caspase 3)抑制剂。在BCNU引起的凋亡基因改变中，bcl 2和bax引起了广泛的关注，二者均属于bcl 2基因家族，在氨基酸序列上有20.8%的同一性和43.2%的相似性，但功能是相互拮抗的。Andrew Lee[4]以BCNU作用于9L胶质肉瘤细胞系，当BCNU浓度分别为100和500 μM，作用48 h后亚二倍体细胞的比例分别为50.4%和95.5%，出现了明显的细胞凋亡，认为BCNU引起了两种不同形式的细胞生长抑制，低浓度时呈现缓慢而持续的抑制细胞形成集落，G2期细胞增多、G1/G0比值下降，其可能的原因是细胞的复制障碍。而高浓度BCNU可以使细胞在48 h内发生凋亡，免疫荧光流式细胞技术发现bax的水平明显升高而bcl 2没有变化，预示了细胞凋亡过程的发生。有学者认为[5]低浓度BCNU可以抑制细胞凋亡蛋白酶，抑制细胞的增殖。本研究中也发现随着缓释微球释放药物时间的延长，细胞凋亡的比例也随之上升，细胞凋亡呈现剂量效应和时间效应。以Hoechst33258标记C6细胞，也发现在高载药量时出现了大量的细胞荧光染色，说明在高浓度BCNU作用下出现了肿瘤细胞核的碎裂和DNA的断裂。

　　胶质瘤的发生与基因异常导致分化失调相关。由于体内外各种因素造成细胞周期调控紊乱，导致细胞增殖与分化，增殖与凋亡失去动态平衡，促进肿瘤形成。凋亡不仅直接影响机体组织的正常发育、分化与死亡，在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视[6]。肿瘤的发生、发展以及对化疗、放疗的耐受都是凋亡的调节功能失常造成的直接后果，已经发现化疗的耐药是由于在药物活化之前药物被细胞膜通道排出或细胞具有某种程度的自身修复机制[7]。胶质瘤对BCNU化疗耐药即是由于O6 甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6 methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)的修复作用。O6 甲基鸟嘌呤(O6 benzylguanine，O6 BG)可以阻断MGMT的活性，Rhines等[8]在给荷瘤大鼠置入BCNU缓释聚合体之前2 h注射O6 BG，发现可以增强脑肿瘤对烷化剂的敏感性，加强局部缓释BCNU的作用，两者协同作用对延长荷瘤动物生存期更加有效，O6 BG起到增效剂的作用，这对我们进一步的研究也是有启发的。

　　细胞凋亡最早期的形态学改变是核染色质固缩，集聚在核膜周边;然后胞浆浓缩、胞膜起泡;既而核碎裂成若干碎片[3]。胞浆膜包裹细胞碎片形成凋亡小体。细胞发生凋亡时，体积缩小，光散射特性改变，胞膜通透性增加，其程度介于正常细胞与坏死细胞之间，利用这一特点，被检细胞悬液用DNA结合荧光素对其DNA进行染色，用流式细胞法检测其荧光强度，区分正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞。由于胞膜通透性增加，核小体间DNA断裂形成的小分子DNA片段由胞内渗出，胞内DNA含量明显降低，在G1/G0期前以特征性的亚二倍体峰形式出现而被识别。

　　AnnexinⅤ联合PI染色法检测早期凋亡细胞较TUNEL法更为灵敏，且不需固定细胞，可避免PI染色法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法固定造成的DNA片段丢失[9]，因此AnnexinⅤ与PI 联合法更省时，结果更为可靠，是目前较为理性的检测细胞凋亡的方法。

　　本研究通过对体外培养大鼠C6胶质瘤细胞在BCNU PLGA MS作用下细胞形态、DNA片段分析及细胞超微结构的研究，发现BCNU PLGA MS可导致细胞的坏死与凋亡，并呈现剂量与时间依赖性，显示了BCNU PLGA缓释微球对C6胶质瘤细胞良好的杀灭作用。本实验结果表明，随着缓释微球释放时间的延长，浓度的增加，明显抑制了C6细胞的增殖活性。

　　细胞持续分裂和不断增殖是肿瘤的基本特征。细胞动力学研究证明，肿瘤细胞是一群非同步增殖的细胞，肿瘤的快速生长并非由于癌变细胞的增殖周期快于正常细胞，而是由于处于静息状态的G0 / G1期细胞在适宜刺激下，大量地重新进入增殖周期，从而导致增殖调节失控的后果[10]。本实验应用MTT比色法，观察BCNU缓释微球对C6细胞生长的影响，药物处理组与空白对照组相比较，药物对C6细胞具有明显的增殖抑制作用(P<0.01)。结合流式细胞仪的细胞周期分析表明，经药物作用后C6细胞G0 / G1期细胞比例增加，S期、G2 /M期比例下降，提示出现了G1期阻滞，故增殖受到了明显的抑制。

　　Shikani[11]以脂肪酸二聚体(fatty acid dimmer,FAD)和癸二酸(SA)组成的聚合体(FAD:SA)为载体，制备载有顺铂、5 Fu、氨甲喋呤、紫杉醇的缓释微球，作用于人类鳞状细胞肉瘤细胞系，发现7 d后96.6%的UM SCC1细胞、86.9%的FADU细胞、94.6%的O11细胞被杀死，而每2 d更换细胞培养液，去除营养成分消耗因素，7 d后分别有74%、94.5%、66.1%的细胞被杀灭。Judy[12]制备载有BCNU的缓释薄膜，作用于培养的9L和F98肿瘤细胞系，在药物作用1 h后更换不含药物的培养基，计数超过50个细胞的克隆数，发现所有细胞克隆均不能存活。Seong等[13]制备载有BCNU的PLGA缓释微球，以硫化玫瑰精染色分析缓释微球对体外培养XF498胶质瘤细胞的毒性作用，发现较低载药量微球在第18～36 d抑制细胞生长达40%，高载药量微球在第4 d抑制70%细胞生长，并呈浓度依赖性。而10μgBCNU粉末在1 h抑制40%细胞生长，但3 h后显示对细胞毒性作用消失，提高BCNU浓度抑制细胞生长比例随之升高，但所有浓度BCNU均在9 h后显示对细胞的毒性作用消失，说明从缓释微球内释放的BCNU均为未降解的活性形式，与我们在体外研究中的结果一致。PLGA微球可以很好的保护内部包载的BCNU不发生降解。本研究发现BCNU在长达2周的时间内对C6胶质瘤细胞起到抑制生长的作用，细胞呈现坏死与凋亡。

　　Lee等[14]将BCNU与PLGA混合后以模具压成片型，置入含9L胶质母细胞瘤细胞的培养基中，2～3 d更换培养基，发现可以持续抑制肿瘤细胞的增殖，而BCNU粉末只能在达到一定剂量后在3 d内抑制细胞增殖，认为BCNU持续以活性形式从PLGA聚合体中释放。

　　体外实验发现，BCNU诱发C6细胞周期变化主要是G1期阻滞，S期细胞迅速下降，G0G1期细胞含量明显上升，具有时间和剂量效应关系。表明C6细胞经BCNU作用后，细胞周期G1/S期检查点的功能受到干扰，进而G1期抑制。这为受损伤细胞提供了充足的时间进行DNA修复，使处于S期的受损伤DNA修复后再进行合成，受损严重的细胞则通过凋亡被消除。而G2M期阻滞并未出现，这可能与C6细胞周期的基因调控和基因突变有关。体外实验中实验组C6细胞随着药物释放时间的延长均出现S期比例下降，G0G1期细胞上升和PI降低的趋势。对照组和实验组的S期比例、G0G1期比例和PI比较均P<0.01。

　　不同载药量微球对胶质瘤细胞G0/G1期细胞比例增加，S期比例减小。流式细胞仪是通过分析计算细胞周期中各个时相的细胞的比例，显示细胞周期的改变，是一个相对量，而不是某个时相的细胞的绝对数量的增加或减少。理论上讲，G0/G1期细胞比例增加既有可能是由于G0/G1期的细胞药物不如S期敏感，而导致凋亡引起的细胞数的减少主要集中在S期，又有可能是药物引起的所谓“G1期阻滞”，细胞较多地停留在G1期所致。但在本实验条件下，24 h后细胞仍处于凋亡的早期，尚未引起明显的活细胞数的减少，因此细胞周期分析时包括了大部分凋亡的瘤细胞，可以近似地认为凋亡检测和细胞周期检测的是同一个细胞群体。因此G0/G1期细胞比例增加而S期的比例减小能够说明药物作用后胶质瘤细胞出现“G1期阻滞”和“S期延迟”。多数学者认为细胞周期紊乱是细胞对外界刺激的一种保护性反应，目的在于保证基因组的遗传稳定性。G1期阻滞和S期延迟可提供充足的时间来促使受损伤的DNA修复，或使处于S期的受损伤DNA修复后再进行合成，损伤严重的细胞则通过凋亡被消除。

　　[参考文献]

　　[1] Fleming AB,Saltzman WM.Pharmacokinetics of the carmustine implant[J].Clin Pharmacokinet,2002; 41:403.

　　[2]Engelhard H H.The role of interstitial BCNUchemotherapy in the treatment of malignant glioma[J].Surg Neurol,2000, 53:458.

　　[3]Hickman MJ, Samson LD. Role of DNA mismatch repair and p53 in signaling induction of apoptosis by alkylating agents[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1999, 96:10764.

　　[4]Henry S, Friedman JP,Jennifer A,et al. Phase I Trial of Carmustine Plus O6 Benzylguanine for Patients With Recurrent or Progressive Malignant Glioma[J]. Journal of Clinical Oncology, 2000,18: 3522.

　　[5]Petak I, Mihalik R, Bauer PI,et al. BCNU is a caspase mediated inhibitor of drug induced apoptosis[J]. Cancer Res,1998, 58:614.

　　[6] Leaver HA, Whittle IR,Wharton SB,et al. Apoptosis in human primary brain tumor[J]. Br J Neurosurg,1998, 12:539.

　　[7] Amirlak B, Couldwell WT. Apoptosis in glioma cell: review and analysis of techniques used for study with focus on the laser scanning cytometer[J].J NeuroOncology, 2003, 63:129.

　　[8]Rhines LD, Sampath P, Dolan ME,et al. O6 benzylguanine potentiates the antitumor effect of locally delivered carmustine against an intracranial rat glioma[J]. Cancer Research,2000, 60: 6307.

　　[9]Mirakian R, Nye K, Palazzo FF,et al. Methods for detecting apoptosis in thyroid disease[J]. J Immunol Methods,2002, 265: 161.

　　[10]Li XN,Du ZW,Huang Q.Modulation effects of hexamethylenebisace tamide on growth and differentitation of cultured human malignant glioma cells[J]. J Neurosurg,1996, 84:831.

　　[11]Shikani AH, Domb A J. Polymer chemotherapy for head and neck cancer[J]. Laryngoscope,2000,110: 907.

　　[12]Judy KD, Olivi A, Buahin KG,et al. Effectiveness of controlled release of a cyclophosphamide derivative with polymers against rat gliomas[J]. J Neurosurg, 1995, 82:481.

　　[13]Seong H, An T.K, Khang G,et al.BCNU loaded poly(D, L lactide co glycolide) wafer and antitumor activity against XF 498 human CNS tumor cells in vitro[J]. Int J Pharm,2003, 251: 1.

　　[14]Lee JS, An TK, Chae GS,et al. Evaluation of in vitro and in vivo antitumor activity of BCNU loaded PLGA wafer against 9L gliosarcoma[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2005, 59: 169.