肉豆蔻提取物对鼠性小胶质细胞的作用机制

　　作者：姜美子 李莉 毛翘 崔春爱 作者单位：延边大学附属医院神经内科，吉林 延吉 133000

　　【摘要】目的 探讨肉豆蔻提取物对鼠性BV2小胶质细胞的抗氧化及神经保护作用。方法 应用WST8试剂盒和western blotting技术，观察肉豆蔻提取物对体外培养的鼠性BV2小胶质细胞的生存率变化及脂多糖(LPS)所诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。结果 肉豆蔻提取物对BV2细胞无毒性，且抑制了谷氨酸的细胞毒性作用和脂多糖所诱导的iNOS的表达，与LPS组之间有显著性差异(P<0.05)。结论 肉豆蔻提取物在体外对鼠性BV2小胶质细胞具有抗氧化及神经保护作用，具有很好的开发潜能。

　　【关键词】 肉豆蔻提取物;小胶质细胞;抗氧化;神经保护

　　阿尔茨海默病(Alzheimer`s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。AD的关键性特征之一是脑内炎症，β淀粉样蛋白沉积，激活小胶质细胞引起的炎症反应是其核心病理机制〔1，2〕。流行病学研究表明，长时间应用非甾体类消炎药可降低患AD的危险性、延缓发病、改善症状的严重性和延缓认识能力的削弱〔3〕，但作为环氧合酶1的抑制剂易导致胃肠道的出血，对肝、肾具有毒性，长期服用时具有一定的危险性。肉豆蔻甲醇提取物是从肉豆蔻科高大乔木植物(Myristica fragrans)中提取的天然成分，可抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)所诱导的大鼠脑内小胶质细胞的激活及空间学习记忆的损害〔4〕。小胶质细胞作为中枢神经系统内的免疫细胞，成为了神经炎症反应中的病因之一〔5〕。因此，如何调控小胶质细胞的功能，使其向保护神经元的方向发展是研究之关键。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　鼠性小胶质细胞BV2细胞株，购于韩国细胞株银行，由本实验室传代培养，冻存于液氮中。细胞培养液DMEM、新生小牛血清及青、链霉素为美国Gibco公司产品;LPS、一抗及二抗为Sigma产品;WST8试剂盒为日本Dojindo产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养

　　BV2细胞以适量浓度接种于直径为100 mm的培养基中，加入10%小牛血清和100 U青、链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5% CO恒温培养箱中培养。

　　1.2.2 肉豆蔻提取物对小胶质细胞BV2的细胞毒作用

　　利用WST8试剂盒，用10 μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml的肉豆蔻提取物处理BV2细胞24 h，设加入生理盐水的阴性对照组，每组重复8孔，重复3次，测定肉豆蔻提取物对BV2细胞生存率的影响。

　　1.2.3 肉豆蔻提取物在谷氨酸细胞毒性下的神经保护作用

　　对数生长的BV2细胞调整至1×105个/ml细胞悬液，接种于直径为60 mm的培养基上，待细胞贴壁稳定后，用5 μg/ml的谷氨酸单处理和终浓度为20 μg/ml的肉豆蔻提取物和谷氨酸复合处理，培养24 h，在倒置显微镜下进行观察。

　　1.2.4 收集细胞，提取蛋白质，检测蛋白表达

　　待细胞贴壁后，空白对照组加入等量的生理盐水，实验组加入1 μg/ml的LPS或加入终浓度为10、20、50 μg/ml的肉豆蔻提取物和LPS，培养24 h后，在冰上收集细胞，提取蛋白质，用Western印迹技术，检测LPS和肉豆蔻提取物对诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表达的影响。

　　2 结 果

　　2.1 肉豆蔻提取物对BV2细胞生存率的影响

　　利用WST8试剂盒检测结果，空白对照组细胞生存率设为100%时，实验各组小胶质细胞生存率分别为98.36%、98.62%和99.12%，与对照组之间无显著性差异(P>0.05)，表明肉豆蔻提取物对小胶质细胞无毒性作用。

　　2.2 肉豆蔻提取物的神经保护作用

　　谷氨酸可以诱导细胞释放细胞毒性因子，对神经细胞具有毒性作用。本实验中，对照组的BV2细胞呈上皮型贴壁生长，细胞呈圆形或椭圆形，细胞间连接紧密，生长旺盛。谷氨酸处理组细胞肿胀，轮廓增强，反差增大，有部分细胞浮起，细胞间接触变松，增殖减慢，细胞周围碎片增多。谷氨酸和肉豆蔻提取物复合处理组细胞呈圆形或椭圆形，细胞间连接紧密，细胞生长旺盛。表明肉豆蔻提取物抑制了谷氨酸对BV2细胞的损害作用，对BV2细胞具有很好的保护作用。

　　2.3 对iNOS表达的影响

　　Western印迹结果显示与空白对照组相比，LPS处理组iNOS表达明显增加，继而与各浓度的肉豆蔻提取物复合处理后，其表达随药物浓度的增加而减少。LPS组与对照组之间有显著性差异(P<0.05)。20 μg/ml和50 μg/ml肉豆蔻提取物处理组与LPS组之间有显著性差异(P<0.05)。见图1A、B。

　　3 讨 论

　　在我国药典中记载Myristica fragrans是肉豆蔻科高大乔木植物肉豆蔻，具有涩肠止泻、温中行气等功能;有文献报导，具有祛风、抗血小板凝集、抗真菌、抗炎等多种作用〔6～8〕。

　　AD的发生和发展伴随着慢性炎症过程，神经免疫炎症变化是神经细胞死亡的重要原因之一，其中小胶质细胞又扮演着相当重要的角色。AD患者脑内有丰富的被激活的小胶质细胞，通过产生过多的过氧化物、谷氨酸和NO，具有潜在的神经毒性作用。谷氨酸是小胶质细胞被激活后产生的兴奋性神经毒物质，在神经细胞缺血缺氧、退行性病变、变性和炎性损伤等方面起重要作用。在本实验中，肉豆蔻提取物作用于BV2细胞24 h，其细胞生存率与对照组相比，无显著性差异，证明对细胞无毒性作用。同时，抑制了由谷氨酸所诱导的细胞毒性作用，进一步表明其对小胶质细胞的神经保护作用。

　　LPS也称为细菌内毒素，可刺激大鼠神经细胞产生炎症因子，注入到第四脑室的LPS可以诱导大鼠的海马、额叶的小胶质细胞活化，最终导致神经炎症病变〔5〕，明显增加了BV2细胞的iNOS的表达，与对照组有显著性差异(P<0.05)。NO广泛存在于各种细胞，在中枢神经系统中起信使和递质样作用，调节脑血流，对神经元具有保护作用。NO作为一种特殊的神经递质参与学习记忆过程，但机体内过多的NO则会出现神经毒性作用。NOS是催化内源性NO的唯一酶类，分为原生型和诱导型两种类型，其中iNOS与NO神经毒性有关。本实验中，肉豆蔻提取物与LPS复合处理后，iNOS的表达随药物浓度的增加而减少，与LPS组之间有显著性差异，发挥抗氧化作用，为AD的防治和新药开发提供了可靠的实验依据。

　　【参考文献】

　　1 Akiyama H，Barger S，Bradt B,et al.Inflammation and Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Aging，2000;21(3)：383421.

　　2 Mc Geer EG，Mc Geer PL.Inflammatory processes in Alzheimer′s disease〔J〕.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2003;27(5)：7419.

　　3 Nilsson SE，Johansson B，Takkinen S,et al.Does adpirin protect against Alzheimer`s dementia?A study in a Swedish populationbased sample aged>or=80 years〔J〕.Eur J Clin Pharmacol，2003;59(4)：3139.

　　4 Cui CA,Jin DQ,Hwang YK,et al.Macelignan attenuates LPSinduced inflammation and reduces LPSinduced spatial learning impairments in rats〔J〕.Neurosci Lett，2008;448(1):1104.

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