毛冬青提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-α及Caspase-3表达的影响

　　作者：盛怀龙，董秀兰，李宝福 作者单位：辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁 锦州121001 ;东丰县医院，吉林 东丰136300

　　【摘要】目的 研究毛冬青提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-α及Caspase-3表达的影响。方法 将健康SD大鼠随机分为：假手术组、模型组、毛冬青三个剂量组。采用线栓法栓塞大鼠右侧大脑中动脉1 h，再灌注24 h，制备大鼠脑缺血再灌注模型。用免疫组化SABC法染色，观察25，50，100 mg·kg-1毛冬青提取物对脑缺血再灌注大鼠的脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响。结果 与假手术组比，CIRI模型组脑组织TNF-α及Caspase-3的表达增加;与CIRI模型组比，各剂量毛冬青提取物均能使脑组织TNF-α及Caspase-3的表达下降。结论 毛冬青提取物能减少脑缺血再灌注损伤后TNF-α及Caspase-3表达的表达，并对脑组织产生一定的保护作用。

　　【关键词】 毛冬青 脑缺血再灌注 肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)

　　Expression of TNF-α and Caspase-3 of Radix Ilecis Pubescens Extract on Focal Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

　　SHENG Huailong，DONG Xiulan，LI Baofu

　　(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China;Hospital of Dongfeng，Dongfeng 136300 China)

　　Abstract: Objective To study the influence of expression of TNF-α and Caspase-3 of Radix ilecis pubescens extract on cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods The healthy SD rates were randomly divided into the sham-operative group, model group and Radix ilecis pubescens extract groups. Focal cerebral ischemia reperfusion model was established in rats through occluding the middle cerebral artery on one side for 1 hour，and then reperfusion for 24 hours to prepare the rats' cerebral ischemia reperfusion model. Use the immunohistochemisty SABC to stain, and observe the influence of Radix ilecis pubescens extract at doses of 25，50，100 mg×kg-1 on the expression of TNF-α and Caspase-3. Results Compared with the sham-operative group：the expression of TNF-α and Caspase-3 of model group increased. Compared with the CIRI group：the Radix ilecis pubescens extract groups can decrease the expression of TNF-α and Caspase-3. Conclusions Radix ilecis pubescens extract can decrease the expression of TNF-α and Caspase-3 after focal cerebral ischemia reperfusion injury, and can protect cerebral.

　　Key words:Radix ilecis pubescens;cerebral ischemia reperfusion;TNF-α;Caspase-3

　　毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青Ilexpubescens hook.et Arn.的干燥根，是我国南方常用的中药，为活血化淤类中药的一种，根含有效成份黄酮苷，还含酚类、甾醇、鞣质、三萜、氨基酸、糖类等多种化学成分[1]。具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效。最近研究毛冬青具有中枢性神经血管调解作用、降低血压、改善脑血流量、抗血小板聚集、抗炎保肾、增强记忆等功能[2]。临床上用于治疗冠心病、缺血性脑血管病、血栓闭塞性脉管炎、肾脏疾病、感染性疾病等并取得一定疗效。由此可见与其治疗缺血性脑血管病相对应的机制的研究只停留在扩张血管及抗血栓作用上。而脑缺血再灌注损伤的机制主要与自由基形成过多、毒性氨基酸产生过多、炎症反应、钙超载、细胞凋亡等有关。本实验通过免疫组化法观察毛冬青提取物对大鼠脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)后脑组织TNF-α 及 Caspase-3表达的影响、测定脑组织含水量和神经行为学评分来探讨毛冬青提取物对脑缺血再灌注损伤的保护作用，为毛冬青的临床应用提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物及分组 健康SD大鼠50 只(由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2003-0007)，雌雄各半，体重180～220 g，随机分为5 组，每组10 只，分别为假手术组、模型组、毛冬青低、中、高剂量组。

　　1.1.2 试验药品及试剂 毛冬青提取物(主要有效成分为黄酮苷，≥10%)，购于西安瑞园生物制品有限公司;TNF-α蛋白测定试剂盒购自武汉博士德生物工程公司、Caspase-3蛋白测定试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。

　　1.1.3 试验仪器 LEICA-RM2135 石蜡切片机(德国莱卡);OLYMPUS 万能显微镜(日本);连续变倍体视显微镜(桂林仪器厂);CIAS-1000型图像分析仪(北京大恒图像视觉有限公司)。

　　1.2 CIRI的制备

　　CIRI模型的建立根据Longa方法：用3.5%水合氯醛按10 mL·kg-1腹腔注射麻醉，颈正中切口，依次分离右侧颈总动脉，右侧颈内、颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉。在颈外动脉和颈内动脉分叉膨大处下方的颈总动脉上剪一小口，将头部圆钝并经多聚赖氨酸处理的鱼线插入颈内动脉，插入长度以分叉处计约18～20 mm，结扎颈内动脉，固定鱼线，缝合。缺血1 h后，固定大鼠，将鱼线抽拉至颈内颈外动脉分叉处，实现再灌注。假手术组麻醉和手术过程与模型组相同，分离右侧颈总动脉及颈内及颈外动脉，结扎颈总和颈外动脉，但不插线。以动物出现不能完全伸展对侧前爪或向外侧划圈或向对侧倾倒作为模型成功的判断标准。

　　1.3 给药剂量及途径

　　将毛冬青提取物加入蒸馏水中配制成5，10，20 g·L-1 3种浓度的灌胃液。毛冬青低、中、高剂量组在造模手术前7 d灌胃给药，给药剂量分别为25，50，100 mg·kg-1，qd，手术前2 h再给药1次。假手术组及模型组给予等体积蒸馏水，给药时间及给药方式相同。

　　1.4

　　1.4.1 神经行为学评分

　　在再灌注24 h后处死前进行神经行为学评分，参照Bederson6级5分标准评定法进行评估：0分为正常;1分为对侧上肢不能完全伸展;2分为向对侧推时抵抗力下降;3分为提尾时向对侧转圈;4分为自动转圈，5分为无自发性活动伴意识障碍。

　　1.4.2 脑组织含水量测定

　　在缺血再灌注24 h后快速取脑，用滤纸吸干脑组织表面水分，取右侧脑组织称重，置于120℃烤箱内烤干18 h至恒重，按以下公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

　　1.4.3 免疫组化法检测缺血再灌注侧脑组织TNF-α及Caspase-3的表达

　　大鼠于缺血再灌注后24 h，用3.5%水合氯醛按10 mL·kg-1腹腔注射麻醉，原切口拆线切开，暴露右侧颈总动脉，用生理盐水约50 mL灌注，然后用4 ℃4%的多聚甲醛液约50 mL灌注固定，断头取脑，取双侧大脑冠状位距嗅球尖端6～11 mm的脑组织块，放入4%的多聚甲醛固定液中继续固定48 h，常规梯度脱水、透明、石蜡包埋。从冠状面中1/3 层面开始留取切片，厚度5 μm，连续切片，切片贴于载玻片上备用，用免疫组化法测定，严格按照说明书进行操作。判断标准：每只大鼠每个指标各取3 张脑组织切片。显微镜下定位，取缺血再灌注侧海马区一区，每张免疫组化切片中采集3个不重复的高倍视野，计数光镜400倍时的阳性细胞数，最终结果取平均值。TNF-α切片细胞浆出现黄色颗粒者为阳性细胞;Caspase-3 切片细胞质或细胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。

　　1.5 统计学处理

　　所测数据以±s表示，采用SPSS15.0统计软件进行统计处理分析，多组间比较采用单因素方差分析的LSD法。

　　2 结果

　　与假手术组比较，CIRI模型组大鼠脑缺血再灌注损伤后神经行为学评分显著增高、脑组织含水量明显增多、脑组织TNF-α及Caspase-3 的表达明显增加，差异均有显著性统计学意义;与CIRI模型组比较，各剂量毛冬青提取物均能使改善各组大鼠的神经行为学评分、使脑组织含水量降低、使脑组织TNF-α及Caspase-3 的表达下降，且呈现一定的剂量依赖性。结果见表1、2及图1、2。

　　表1 各组大鼠神经行为学评分及脑组织含水量的变化(略)

　　表2 毛冬青提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织TNF-α及Caspase-3表达的影响(略)

　　与假手术组比较，a：P<0.01;与CIRI模型组比较，b：P <0.05; c：P <0.01

　　3 讨论

　　CIRI是指脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍的现象。缺血再灌注损伤是一种多因素参与的极其复杂的病理生理过程，包括很多环节，并且各个环节之间存在着相互作用。

　　脑缺血再灌注过程中，炎症反应介导了脑缺血再灌注损伤，而炎症细胞的聚集、浸润及炎性因子的释放是炎症反应发生、发展的关键步骤。现已证实，炎症反应触发的脑缺血再灌注损伤的机制主要为炎症细胞产生的大量细胞因子及酶类加重组织的损伤，如损伤神经组织的生物膜，导致细胞源性及血管源性脑水肿。TNF-α是被激活的巨噬细胞分泌的一种细胞因子，具有广泛的生物学功能，在脑缺血再灌注损伤过程中可以刺激急性蛋白分泌，增加内皮细胞通透性，诱导其他炎症细胞因子和细胞粘附因子等的表达[3]。有实验证实SD大鼠脑缺血再灌注损伤后大脑缺血半球的炎症细胞因子和细胞粘附分子mRNA水平升高，其中TNF-α表达明显高于健侧大脑半球[4]。本研究显示，毛冬青提取物各剂量均可降低大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑组织TNF-α的过度表达。

　　细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤关系密切，目前认为细胞凋亡及多种基因表达的改变及相互间的调控在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中起重要作用[5]。有研究表明，Caspase家族的某些成员参与了凋亡的信号传导，具有重要的调控和效应作用，其中Caspase-3 的达和活化水平的异常升高则是启动凋亡的关键环节[6，7]。脑缺血后，神经细胞凋亡主要有两种途径：(1)线粒体依赖性：当神经细胞受到各种因素的刺激(如缺血、缺氧等),细胞色素C(CytC)从线粒体释放到胞质[8]，与dATP、凋亡蛋白酶激活因子结合成复合物，激活Caspase-9，Caspase-9切割后激活Caspase-3，Caspase-3 被认为是凋亡的最终执行蛋白。Bc1-2 家族能调节线粒体膜的通透性，促凋亡基因产物Bax蛋白能增加线粒体膜的通透性，增加CytC的释放，从而激活Caspase-3。(2)非线粒体依赖性：Fas-L以同源三聚体复合物形式存在，每一个Fas-L三聚体可结合三个Fas分子，导致三个Fas分子内的DD (Death domain)相互串联。串联的Fas的DD可以与FADD(Fas-associated death domain)的DD结合，这种结合又导致FADD的DED(Death effect domain)与Caspase-8 酶原的DED类似区域结合，从而激活Caspase-8，Caspase-8 进一步激活下游的Caspase-3，最终导致细胞凋亡。可见凋亡的关键步骤是Caspase-3 的激活，其底物有：聚腺苷二磷酸核糖多聚酶、DNA蛋白激酶，这些蛋白的切割溶解直接导致凋亡特征性变的出现：染色质浓缩、DNA片段化、凋亡小体[9，10]。本实验研究证实，模型组与假手术组比较，Caspase-3 表达明显增加，毛冬青提取物各剂量组的脑组织Caspase-3 表达较模型组降低，且呈一定的剂量反应关系。

　　本研究结果表明，毛冬青提取物可减少缺血再灌注损伤后的脑组织TNF-α及Caspase-3的表达、改善神经功能学评分、降低脑组织含水量，从而减轻脑缺血再灌注损伤，起到一定的神经保护作用。

　　(此文图1-2见附页8)(略)

　　【参考文献】

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