2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠海马组织iNOS的表达及原花青素的干预

　　作者：宋晓伟,闵连秋 作者单位：辽宁医学院附属第一医院神经内科，辽宁 锦州121001

　　【摘要】目的 探讨2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量的变化及原花青素(procyanidin, PC)对其表达的影响。方法 将30例大鼠随机分为假手术组、 2型糖尿病单纯脑缺血组及PC低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)及高剂量组 (200 mg/kg)，于脑缺血后24 h进行HE染色，免疫组化法测定海马组织iNOS含量。结果 2型糖尿病局灶性缺血组大鼠海马组织iNOS活性明显降低(P<0.01);PC低、中、高剂量组均不同程度降低iNOS活性(P<0.01)，改善神经细胞的受损程度：其中以中、高剂量组明显(P<0.05)，但中、高剂量组间无明显差异(P>0.05)。结论 PC对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠能够降低海马组织iNOS的活性。

　　【关键词】 糖尿病 脑缺血 原花青素 诱导型一氧化氮合酶

　　Effect of Procyanidin on Expression of Inos in Type 2 Diabetes Mellitus Rats with Focal Cerebral Ischemia

　　SONG Xiaowei， MIN Lianqiu

　　(Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)

　　Abstract: Objective To investigate the content of induced nitricoxide synthase in hippocampus tissue of type 2 diabetes mellitus rats with focal cerebral ischemia and effects of procyanidin (PC) on it. Methods Thirty SD rats were divided into sham-operation, model, low-dose PC, mid-dose PC and high-dose PC group. After ischemia for 24h, we performed hematoxylin and eosin (HE) staining; the expression of iNOS was examined by immunohistochemical SABC method. Results Compared with sham-operation group, the increased number of the positive iNOS cells in cerebral hippocampus of model group, the difference between the two groups was of significant (P<0.01). Compared with model group, the PC groups possessed lower the positive cells of iNOS. The medium-dose and high-dose groups' effects were more obvious compared with the low-dose groups (P<0.05), but there was no difference between the two groups (P>0.05). Conclusions PC can reduce the activity of procyanidin on expression of iNOS in type 2 diabetes mellitus rats with focal cerebral ischemia.

　　Key words: procyanidin;diabetes mellitus;cerebral ischemia;iNOS

　　原花青素(procyanidin, PC)是一类植物和食品中广泛存在的多酚化合物的总称，由不同数量的儿茶素和表儿茶素缩和而成，其含大量活性酚羟基使其具有很强的抗氧化及清除各种活性氧自由基的能力[1]。本文进一步探讨了其对2型糖尿病SD大鼠局灶性脑缺血模型海马组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)高表达的抑制作用, 为其临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 选用健康雄性SD大鼠36只，体重180～240 g(辽宁医学院实验动物中心提供)。许可证号：SCXK(辽)。实验动物级别：普通级。

　　1.2 实验分组 36只大鼠随机分为假手术组、模型组(2型糖尿病大鼠单纯缺血组)、3个PC剂量组，每组6 只大鼠。PC组在建立2型糖尿病模型后给予灌胃，1 次/24 h，连续1周，于大脑中动脉闭塞(MCAO)术前1 h再灌胃1次。PC低剂量、中剂量、高剂量组分别以PC粉剂50、100、200 mg/kg，每次蒸馏水配制成悬浮液灌胃，其他各组以相同的给药方法给予生理盐水(NS) 1 mL/kg。

　　1.3 型糖尿病大鼠局灶性脑缺血模型的制备 第一步取SD大鼠每笼5 只，常规饲料适应性饲养1 周，然后喂饲高脂高糖饲料(10%猪油，2.5%胆固醇，1.0%猪胆酸盐，20.0%蔗糖，66.5%常规饲料[2])。4周后，诱导出高胰岛素血症和胰岛素抵抗，按25mg/kg体重的剂量一次性尾静脉注射STZ溶液(临用前以0.1 mol/L pH值4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成0.5%的溶液)。72 h后取尾血测血糖，超过16.7 mmol/L为2型糖尿病大鼠[3]。第二步选取2型糖尿病SD大鼠造模成功后2周后按照文献[4]进行进行大鼠局灶性脑缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的制作。栓线鼠即刻出现左侧Horner征或麻醉苏醒时出现右侧前肢内收屈曲或爬行时向右侧划圈或倾倒为造模成功。

　　1.4 脑组织病理形态学采用HE染色 大鼠以10%水合氯醛(0.3 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，打开颈部，暴露颈右总动脉，插管，先输注生理盐水约50 mL，然后输注4%多聚甲醛约50 mL，断头取脑。甲醛固定，冠状脑片制备，选择梗死中心(即最大层面)，常规酒精脱水，石蜡包埋，制成4～6 mm厚的切片，附片，行苏木素-伊红(HE)染色，分别观察梗死中心区、梗死周边区脑组织(海马CAl区、CA3区)，前述区域神经细胞和血管内皮细胞(每个观察区选择具有代表性标本观察结果并记录)。

　　1.5 免疫组化法检测缺血侧大脑海马CA1区iNOS的表达 造模后24 h，大鼠以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉后固定，颈正中偏右切口，暴露右颈总动脉，用NS约50 mL灌注，然后用4 ℃ 4%多聚甲醛液约50 mL灌注固定，24 h断头取脑，取双侧大脑冠状位距嗅球尖端6～11 mm的脑组织块，放入4%多聚甲醛固定液中继续固定24 h，常规梯度脱水、透明、石蜡包埋。从冠状面中1/3层面开始留取切片，厚度5 mm，连续切片，切片贴附于经APES处理的载玻片上，备用。用免疫组化法测定。严格按试剂盒说明书进行操作。观察大鼠海马CA1区，每张取4个视野数用图像用分析仪计算iNOS阳性细胞数，取其平均值。

　　1.6 统计学处理 实验数据用均数±标准差 (±s)表示，采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析和q检验等统计分析。

　　2 结果

　　2.1 大鼠海马CA1区脑组织病理形态学 HE染色(× 200)光学显微镜下观察，除假手术组(图1)外各组均可见正常神经元和损伤神经元，见正常神经元核圆形，边界及核仁清楚;损伤神经元胞核肿大，偏位，核仁消失，胞浆着色浅、苍白或核浓缩、深染，细胞呈三角形缺血性坏死变化。损伤神经元上述特点在模型组表现得更明显(图2);PC组(图3、4、5)能不同程度的改善神经细胞的核深染、核固缩程度，减少细胞及间质的水肿，使胞膜清楚，形态正常，核仁清晰可见的神经细胞数目增多。

　　2.2 大鼠海马组织CA1区iNOS表达 与假手术组相比，模型组iNOS免疫阳性细胞出现高表达, iNOS阳性细胞形态呈椭圆形、三角形、胞质染色均匀，有显著性差异(P<0.01);与模型组相比，原花青素各组均降低iNOS免疫阳性细胞的数目(P<0.01)，其中中、高剂量组较低剂量组效果更明显(P<0.05)，且两组间无明显差异(P>0.05)，假手术组基本不表达。结果见表1。

　　表1 原花青素对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠缺血侧海马CA1区iNOS平均阳性细胞数的影响(略)

　　与单纯缺血组相比，a：P<0.01;与模型组相比，b：P<0.01;与低剂量组相比，c：P<0.05

　　3 讨论

　　糖尿病是脑梗死的的独立危险因素，血糖升高不但作为重要的危险因素参与脑梗死的发病过程，导致疾病的发病率增高，而且对脑梗死发生后病理过程又促进作用，加重脑组织缺血性损伤和病情，影响预后[5]。高血糖加重脑缺血性损伤的机制有许多种，其中之一就是一氧化氮(NO)的毒性机制。Ste-Marie等[6]研究发现，高血糖可以引起兴奋性递质谷氨酸增多，导致Ca2+增高有关，一氧化氮合酶(NOS)表达增高导致NO的合成增多，使NO产生增多，并能提高NO的生物利用度，过量的NO产生和释放，可以通过自由基或其他途径产生神经毒性，加重神经元损害。

　　NOS是催化L-精氨酸生成内源性NO的限速酶，根据其存在部位及作用机制不同，分为内皮型(eNOS)、神经元型(nNOS)和诱导型 (iNOS)。NO在脑缺血性损伤的发生和发展过程中有双重作用。在脑缺血早期，eNOS介导生成的NO通过扩张血管改善缺血区的血液供应，具有短时的保护作用，随着NO的大量产生，由nNOS和iNOS介导的神经毒性效应很快占优势，分别在脑缺血进展期和晚期介导神经毒性作用，造成神经元的损伤[7]。

　　PC具有抗氧化、降低毛细血管通透性和对心血管具有多种药理作用[8-10]。PC抗氧化活性使其可抑制诸如组织胺、5羟色胺、前列腺素及白三烯等炎症因子的合成和释放。在本实验中PC组能够明显减少2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织的iNOS平均阳性细胞表达数(P<0.01)，减轻神经元损伤，尤以中、高剂量组作用显著(P<0.01)，推测PC神经保护作用的机制可能是通过抗氧自由基作用抑制炎症反应，降低iNOS含量，减少神经毒性NO的产生，进一步发挥抗自由基作用，从而起到神经保护作用。

　　国内外关于PC的神经保护作用研究较少，尚未发现有PC对2型糖尿病局灶性脑缺血后海马组织iNOS表达影响的相关报道。本研究从此角度研究PC的保护作用，从而对临床应用PC提供了证据。(此文图1-5见附页7)

　　【参考文献】

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