大骨瓣减压在重度颅脑损伤中应用的实验研究

　　作者：徐武,梁维邦,倪红斌,杨咏波 作者单位：210008 南京医科大学鼓楼临床医学院(徐武);南京大学医学院附属鼓楼医院神经外科(梁维邦，倪红斌，杨咏波 )

　　【摘要】 目的 评价大骨瓣减压对实验性重度颅脑损伤大鼠的作用。方法 取90只SD大鼠，制作重度颅脑损伤模型，分为保留骨瓣对照组，常规骨瓣减压组，大骨瓣减压组，观察各组生存率，血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)，凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax，并用电子显微镜观察脑组织超微结构。结果 大骨瓣减压组生存率高于其他两组，NSE降低，Bax，Bcl-2降低，神经元内质网，线粒体肿胀较轻。结论 大骨瓣减压能显著降低重度颅脑损伤大鼠的死亡率，减轻脑水肿。

　　【关键词】 大骨瓣减压，重度颅脑损伤，NSE，Bax，Bcl-2

　　Laboratory study of large decomprssion craniotomy in severe traumatic cerebral injury XU Wu,LIANG Wei-bang,NI Hong-bin,et al.Drum Tower Clinical Medical College,Nanjing Medical University,Nanjing 210008,China

　　Abstract:Objective To study the surgical treatment of severe traumatic cerebral injury by large decompression craniotomies.Methods 90 Sprague-Dawley rats were subjected to severe cerebral injury models and randomly divided into three groups as follows:control group, normal decompression craniotomies group and large decompression craniotomies group,each contained 30 rats. Survival rate，neuron specific enolase levels (NSE) Bax and Bcl-2 expressions were observed.The brain tissue ultrastructure was investigated with electric microscope.Results Survival rate of large decompression craniotomies group exceeds that of other groups. NSE,Bax and Bcl-2 decreased.The engorgement of cerebral endoplasmic reticulum and mitochondria is lighter of large decompression craniotomy.Conclusions Large decompression craniotomies cuts down death rate of severe traumatic cerebral injury rats and mitigates cerebral edema.

　　Key words:large decompression craniotomy;severe traumatic cerebral injury; NSE; Bax; Bcl-2

　　去大骨瓣减压术是有效治疗重度颅脑外伤的方法之一，广泛地应用于临床，但缺乏前瞻性的动物实验研究支持。本实验通过建立均一的大鼠脑外伤模型，探讨去大骨瓣减压术在重度颅脑外伤中的治疗价值。

　　1 资料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 150只雄性健康成年Sprague-Dawley大鼠,体重200~300 g(南京大学动物实验中心提供)，制作重度脑外伤模型后，取90只存活者随机分为保留骨瓣对照组，常规去骨瓣组，去大骨瓣组，每组30只。

　　1.1.2 试剂与仪器 大鼠NSE试剂盒(美国Adlitteram 诊断试剂公司提供)，大鼠Bax，Bcl-2免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)，电子显微镜(南京医科大学电子显微镜室)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重度颅脑损伤大鼠模型 采用改良的Feeney法制作脑外伤模型。

　　1.2.2 血清NSE测定 每组随机取5只大鼠于实验前，术后24 h，72 h，7 d，14 d取静脉血1 ml，3 000转/分离心后取上清，行酶联免疫吸附法定量测定NSE，实验步骤按说明书进行。

　　1.2.3 Bax，Bcl-2免疫组化染色 于术前，术后24 h，72 h，7 d，14 d，每组各取5只大鼠，麻醉后，切开大鼠胸腔，暴露心脏，左心室留置静脉针，于左心耳处剪开左心房，冰生理盐水300 ml冲洗灌注，直至流出液清澈，再给予4℃4%多聚甲醛0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)250 ml灌注固定，断头取脑，石蜡切片，常规脱蜡至水，EDTA(pH8.0)高压修复2 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，3%H2O2去离子水孵育5 min，室温羊血清封闭20 min，滴加一抗(1:100)，4℃孵育过夜，PBS冲洗，滴加非生物素二抗(PV-6001),孵育20 min，PBS冲洗，DAB显色，自来水冲洗，苏木素衬染，透明封片。以细胞胞浆呈棕黄色着色为阳性细胞，计算每高倍视野(40×)下阳性细胞数。

　　1.2.4 电子显微镜观察 于术后24 h，72 h，7 d，14 d，每组各取两只大鼠行断头取脑，取脑挫裂伤灶边缘部1 mm3脑组织浸于5%戊二醛PBS缓冲液,锇酸固定,梯度酒精脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,电镜观察,照片。

　　2 结 果

　　2.1 对照组术后死亡13只，存活者均有右侧肢体近完全瘫痪，死亡率为43.33%，常规骨瓣减压组死亡11只，死亡率为36.67%，但存活大鼠右侧肢体功能障碍稍轻，划圈运动，大骨瓣减压组死亡4只，死亡率为15.38%，且肢体功能障碍明显轻于对照组和常规骨瓣减压组。

　　2.3 免疫组织化学测定Bax，Bcl-2表达 表2 各组Bax免疫组化染色计数：±s(个)注:*，△同时间点不同组间显著性差异(P<0.05) 表3 各组Bcl-2免疫组化染色计数：±s(个) 注:* ,△同时间段不同组间有显著差异(P<0.05)

　　2.4 电子显微镜观察 术后第一天脑细胞线粒体，内质网肿胀轻微，脑毛细血管内皮细胞肿胀，结构发生改变,管腔面不光滑,微绒毛及内皮小凹形成增多，各组间无明显差异，72 h及7 d时，毛细血管内皮细胞损伤及星形胶质细胞肿胀加重，出现裸核，神经细胞核固缩，胞浆内的高尔基体肿胀，线粒体肿胀空泡化，并有棘断裂，内质网扩张，髓鞘崩解，同时期相比对照组最重，去大骨瓣组最轻。

　　2.5 统计学处理 采用SPSS1.0软件包进行数理统计分析，NSE、Bax、Bcl-2实验结果以均数±标准差(±s)表示，组间及组内比较用方差分析，死亡率的比较采用X2检验，P<0.05差异有统计学意义。

　　3 讨 论

　　打击后大鼠大体标本可见左额顶颞部广泛的脑组织坏死，缺损，对照组死亡率与Quigley[1]等大样本统计数据基本一致，重度颅脑损伤造模成功。检测血中的NSE可以早期诊断并评价脑损伤的程度，因此监测外周血的NSE变化,可了解神经元细胞坏死的情况及严重程度[2~4]。NSE在脑损伤后24 h内开始增高，3~7 d时增高明显，提示脑水肿后，神经元继发损伤所致，但大骨瓣减压组低于常规骨瓣组，更低于对照组。电镜下观察结果也提示对照组脑组织线粒体，内质网肿胀程度最重，而去大骨瓣组最轻。随时间延长，大骨瓣减压组NSE开始在7 d时下降，而对照组及常规骨瓣减压组较72 h增高，尤以对照组增高明显，各组间然有显著差异。说明去大骨瓣后，有效地减轻了脑水肿，而对照组和常规去骨瓣组，因未减压或减压不充分，导致脑水肿持续加重。至14 d三组脑水肿基本消退，NSE恢复至接近术前水平。

　　有研究认为，细胞凋亡参与了脑外伤后的细胞死亡,并与继发性脑损伤密切相关[5]，Bax可通过其自身形成的Bax同二聚体和(或)与Bcl-2形成Bax-Bcl-2异二聚体而发挥作用,Bax同二聚体促进细胞凋亡,Bax-Bcl-2异二聚体则抑制细胞凋亡，Bax/Bcl-2比值决定细胞是否凋亡[6]。凋亡促进因素包括缺血,缺氧，损伤等,在有致凋亡因素作用后，6 h即可检测出Bcl-2,24 h后即可监测出Bax[7]。本实验在术后72 h测得Bax，Bcl-2及其比值较24 h时有明显提高，对照组与常规骨瓣减压组，大骨瓣减压组有差异，说明术后脑水肿开始参与触发凋亡，常规骨瓣减压组，大骨瓣减压组因脑组织有代偿空间，凋亡较对照组少，但两组间仍有差异。此后脑水肿持续加重，脑细胞凋亡增加，三组间差异显著，对照组凋亡最多，大骨瓣减压组最少。结合大鼠死亡率考虑，说明脑水肿导致的细胞凋亡参与了外伤后的脑损伤机制，并是导致死亡的重要因素，而大骨瓣减压是最有效的针对性治疗手段。

　　3 d和7 d时，线粒体，内质网明显肿胀，且对照组重于常规去骨瓣组，常规去骨瓣组重于去大骨瓣组，说明去大骨瓣后，由于显著增加了颅腔的代偿空间，脑组织二次损伤较轻，而常规骨瓣减压组，因代偿不充分，正常脑组织受压，仍存在较严重的二次损伤，但稍好于对照组。术后大骨瓣减压组死亡率最小，与临床所得资料统计相似[8，9]，可以证实去大骨瓣减压术后，可显著提高重度颅脑损伤的生存率，降低死亡率，改善预后[10,11]。常规骨瓣减压组死亡率较高，且接近对照组，作者认为除因骨窗小，减压不充分外，还可能有脑肿胀后，脑组织疝出，嵌顿于小骨窗，静脉受压等相关。

　　【参考文献】

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