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《神经外科学》

脑出血大鼠脑内胚胎神经干细胞移植的运动神经功能改变和形态学研究

发表时间:2011-07-13  浏览次数:445次

  作者:洪芳芳,王振忠,诸葛启钏 作者单位:1.余姚市人民医院 浙江余姚 ;2.温州医学院附属第一医院神经外科,浙江温州

  【摘要】 目的 研究脑出血大鼠脑内胚胎神经干细胞移植对运动神经功能改善作用以及移植细胞分化后形态学改变。方法 通过大鼠尾状核注射胶原酶IV制作脑出血模型大鼠,分离培养胚胎神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内。对脑出血大鼠移植前后运动神经功能进行评价,并通过组织免疫荧光检测移植神经干细胞脑内分化后形态学改变情况。结果 Hoechst标记的神经干细胞移植入脑出血大鼠后可见其在脑内存活,主要分布于血肿腔周边,免疫荧光检测显示移植细胞能进一步分化为神经元及星形胶质细胞;从移植术后第21天到第28天,神经干细胞移植组大鼠的神经功能改善显著好于培养液移植组和单纯脑出血组,有统计学意义(P<0.001)。结论 胚胎神经干细胞脑出血大鼠脑内移植能促进偏瘫肢体功能恢复;胚胎神经干细胞脑出血大鼠脑内移植后能存活并进一步分化为神经元及星形胶质细胞。

  【关键词】 神经干细胞,脑出血模型,细胞移植,神经功能缺损,形态学

  Experimental Study on Graft Cell Morphological Changes and Improvement of Motor Neural Function after Brain Transplantation of Embryonic Neural Stem Cells in Rats Intracerebral Hemorrhage Stroke Model. HONG Fang_fang, WANG Zhen_zhong, ZHU GE Qi_chuan, The people's hospital of yuyao city, zhejiang 315400, China

  [Abstract] Objective To explore the effect of embryonic neural stem cells(NSC) transplantation on neural functional recovery and differentiation of graft cells in intracerebral hemorrhage(ICH) rats. Methods Experimental ICH rats were established by injection of collagenase Ⅳ into caudate putamen. Thirty ICD rats were randomly divided into three groups:①control group:ICD rats without transplantation; ②culture medium transplantation group;③NSC transplantation group. Functional recovery was evaluated by the motor function detection before and after NSC or culture medium transplantation. Differentiation of graft cells in ICH rat models was observed by immunofluorescence. Results Immunohistological result confirmed that the transplanted stem cells differentiated into neurons or glials around the cavea of hematoma. And from the 21st day to the 28th day after transplantation, the motor neural function in NSC transplantation group recovered much better than in control group and culture medium transplantation group(P<0.001). Conclusions The embryonic neural stem cells transplanted into ICH rat can improve the neural function in rat. The transplanted neural stem cells can survive and differentiate into neurons and glials.

  [Key words] Neural stem cells; Intracerebral hemorrhage model; Cell transplantation; Neural function; Morphological; Rats

  出血性脑卒中是脑血管病中病死率和致残率很高的一种疾患。大部分的出血性脑卒中主要靠药物治疗,部分病患需要实施外科手术,但到目前为止并没有任何一种药物或手术可以使病患完全康复。神经干细胞(neural stem cell,NSCs)是具有自我更新、多向分化和再生细胞能力的细胞,并能分化为神经元及胶质细胞,成为神经系统细胞移植的一个重要选择[1]。本文探讨外源性神经干细胞是否能够在脑出血大鼠脑内存活分化并促进运动神经功能损伤的修复,实验结果如下。

  1 材料和方法

  1.1 实验动物和试剂:30只雄性SD大鼠,体重300g左右,14天孕鼠2只,购于温州医学院实验动物中心。培养液及添加因子(Gibco产品):DMEM/F12,N2,B27,bFGF(20ng/ml),EGF(20ng/ml),L_谷氨酰胺,青链霉素;一抗:nestin(鼠单抗,Chemicon),Neun(鼠单抗,Chemicon),GFAP(兔多抗,北京中杉金桥);二抗:FITC(羊抗小鼠IgG,Chemicon),Cy3(羊抗兔IgG,Chemicon);Hoechst 33342(Sigma)。

  1.2 脑出血模型制作:10%的水合氯醛腹腔内注射麻醉后,立体定向仪固定大鼠;以前囟为中心,右侧旁开3.0mm,硬脑膜开始深6.0mm定位右侧尾壳核;将3μl配好的含0.25U/μl IV型胶原酶注入尾壳核。

  1.3 神经干细胞准备:①NSCs单细胞悬液制作:培养6天后神经球[2],经0.02%EDTA消化成单细胞悬液,0.4%台盼蓝染色计数,调整密度2.0×107/100μl;②移植前20min细胞进行Hochest染色标记;

  1.4 实验分组:单纯脑出血组(A组,10只),脑出血+培养液移植组(B组,10只),脑出血+NSCs移植组(C组,10只)。

  1.5 移植:脑出血术后3天,立体定向仪固定大鼠后,将5μl单细胞悬液注入相应大鼠患侧尾壳核内,等量培养液注入对照组,约10min注射完,留针10min。

  1.6 神经功能学评分:各组大鼠分别在移植前1h,移植后7天,14天,21天,28天参考Rosenberg GA[3]进行神经功能学评分:①有无自发性向血肿同侧“划圈样”行走现象,从0级(无转圈)到3级(持续转圈)进行分级;②将大鼠的左侧后肢向外拉2~3cm,观察其收缩情况,从0级(立即收缩到原位)到3级(在数秒后收缩到原位或无收缩)进行分级;③通过2.4×80cm窄木条的能力,从0级(顺利通过)到3级(在木条上站立<10s)进行分级;将3种检查的分级分数相加,即为该大鼠的运动功能评分(0~9分)。

  1.7 荧光免疫组织化学检测:移植术后第4周,神经功能学评价后将3组(A、B、C)各取3只大鼠脑组织进行NeuN、GFAP荧光免疫组织化学染色检测,简要步骤如下:①新鲜的脑组织快速制作成10μm冰冻切片;②加一抗NeuN(1:200)、GFAP(1:50)各100μl4℃过夜;③PBS冲洗后,加二抗FITC抗鼠IgG(1:100)、Cy3抗兔IgG(1:200) 各100μl室温下避光45分钟;④PBS冲洗后封片,在330~380nm,450~490nm及510~540nm波长荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察拍照。

  1.8 统计学方法:所有数据经SPSS 13.0软件包统计学处理,计量资料结果以均数±标准差(x-±s)表示。组内两两比较有无显著差异根据结果选择LSD_t或者Dunnett_t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 NSCs培养及鉴定:经6天培养后,NSCs分裂增殖形成由数十个至数百个细胞构成的神经细胞球(见图1a,在封底),达到移植要求数量。神经细胞球贴壁2h后,nestin抗体鉴定显示强烈绿色荧光(见图1b,在封底),证明为神经干细胞。

  2.2 神经功能学评价:见表1。表1 神经功能学评分(改善分值)注:移植后21天,与A、B组比:*P<0.01;移植后28天,与A、B组比:#P<0.01

  2.3 荧光标记NSCs观察:荧光显微镜观察可见大量Hoechst标记的蓝色细胞核,证实了Hoechst33342标记NSCs在大鼠脑内存活,细胞从注射部位向上下迁移并分布于整个损伤处的附近,移植细胞主要分布于血肿腔的周边。见图2a、2b,在封底。

  2.4 移植NSCs在大鼠脑内分化情况:用hoechst同NeuN及GFAP的免疫荧光双标了解移植细胞的分化情况。结果中hoechst阳性细胞细胞核呈蓝色,NeuN阳性细胞标记FITC,呈绿色,两者重合的地方即表示移植的细胞分化为神经元;GFAP阳性细胞用cy3标记显色,表现为红色,其与hoechst标记的蓝色细胞核交叠的部分即是双标阳性,表示移植细胞分化成星形胶质细胞。见图3,在封底。

  3 讨论

  2003年,Jeong[4]等报告将NSCs移植入脑出血模型大鼠脑内,通过肢体功能测试结果表明,NSCs移植组大鼠的肢体功能在两周后恢复程度较对照组改善明显,免疫组化证实移植细胞能进一步分化为神经元及星形胶质细胞。Zhang H等[5]将干细胞植入脑出血大鼠的尾状核附近,植入部位与脑出血部位相邻,缩短干细胞的迁徙时间,可以更加有效的发挥干细胞的神经功能修复作用。本实验中将神经干细胞直接移植入脑出血大鼠尾状核周边,经免疫荧光染色可以观察到血肿周围移植NSCs的存活并进一步分化为神经元及胶质细胞。脑出血大鼠术后随着时间推移均能不同程度的逐渐恢复神经功能。而在移植术后2周时间内恢复较缓慢,但从第21天到第28天,神经干细胞移植组恢复明显优于培养液移植组及单纯脑出血组。国内安沂华[6]等研究显示在移植术后3周内,血肿同侧神经干细胞移植组跟另外三组对照组的运动功能评分无明显差异,但从28天到第42天血肿同侧移植组动物的运动功能恢复程度明显好于血肿对侧移植组及血肿对照组。

  对于临床脑出血患者,脑出血造成的损伤包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤主要是对邻近组织破坏和血肿本身的占位效应,继发性损伤是指由血肿所产生的酶、红细胞、血红蛋白、铁离子和机体炎症反应等所介导的一系列损伤。这些损伤造成机体血肿周边大量细胞的凋亡、坏死以及神经信号传导通路中断从而导致神经功能缺损。尽管实验研究表明移植细胞能促进出血性脑卒中实验大鼠肢体功能的恢复,但是对于移植细胞是如何减少宿主神经细胞的凋亡、坏死并恢复受损细胞功能,并分化为大量功能细胞参与脑的三维重建恢复信号传导通路,这些机制多还未能完全阐明[7]。NSCs移植后能促进肢体功能进一步恢复的机制可能存在以下情况,1)神经营养因子释放:移植细胞能释放某些蛋白因子,改善宿主损伤区域微环境,促进受损宿主神经元的修复或者减少宿主神经元的凋亡。Lee[8]等将神经干细胞系HB1.F3进行RT_PCR检测,显示GDNF、BDNF、NGF、NT3、IGF_1、bFGF等一系列营养因子基因序列存在,收集体外细胞培养液进行酶联免疫分析检测显示细胞分泌出较高浓度的NGF及BDNF,同时移植后血肿腔周边荧光检测表明部分移植细胞分泌出NGF及BDNF。2)轴突损伤修复:移植细胞可能通过为轴突再生提供基质、使轴突主动再生等作用重构轴突间联系从而恢复信号传导通路。Parent及Scharfman[9、10]等研究显示,在海马内,NSCs能进一步分化为功能性颗粒细胞,接受嗅皮质的树突信号传入,并伸展出轴突,将信号传导入神经元核内或CA3区域内,不管内生性及外源性NSCs要发挥治疗作用均需要新来源细胞与原宿主细胞形成融洽结合,形成信号传导。3)替代宿主细胞作用:移植细胞能分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞,替代部分受损的宿主细胞来完成正常的功能。4)减轻炎症反应。

  本实验结果表明NSCs能促进脑出血大鼠运动神经功能恢复,但其潜在机制尚不清楚,需要进一步研究。

  【参考文献】

  [1]王忠诚,于春江.神经干细胞研究进展[J].心脑血管病防治,2004,4(3):2-7.

  [2]苏志鹏,叶盛,诸葛启钏.大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定[J].温州医学院学报,2005,35(5):449-451.

  [3]Rosenberg GA, Mun_Bryce S, Wesley M,et al.Collagenase_induced intracerebral hemorrhage in rats[J].Stroke,1990,21(5):801-807.

  [4]Jeong SW, Chu K, Jung KH, et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage[J]. Stroke,2003,34(9):2258-2263.

  [5]Zhang H, Huang Z, Xu Y, et al. Differentiation and neurological benefit of the mesenchymal stem cells transplanted into the rat brain following intracerebral hemorrhage[J]. Neurol Res, 2006,28(1):104-112.

  [6]An YH, Wang HY, Gao ZX, et al. Differentiation of rat neural stem cells and its relationship with environment[J]. Biomed Environ Sci, 2004,17(1):1-7.

  [7]Martino G, Pluchino S. The therapeutic potential of neural stem cells[J]. Nat Rev Neurosci, 2006,7(5):395-406.

  [8]Lee HJ, Kim KS, Kim EJ, et al. Brain transplantation of immortalized human neural stem cells promotes functional recovery in mouse intracerebral hemorrhage stroke model[J]. Stem Cells, 2007,25(5):1204-1212.

  [9]Parent JM, Elliott RC, Pleasure SJ, et al. Aberrant seizure_induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy[J]. Ann Neurol, 2006,59(1):81-91.

  [10] Scharfman HE, Sollas AE, Berger RE, et al. Perforant path activation of ectopic granule cells that are born after pilocarpine_induced seizures[J]. Neuroscience,2003,121(4):1017-1029.

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