卡莫司汀对C6胶质瘤细胞凋亡作用机制的研究

　　作者：王鑫 作者单位：昆明医学院第一附属医院神经外科， 云南 昆明 650032

　　【摘要】 目的 研究卡莫司汀 (BCNU) 对胶质瘤凋亡的作用机制。 方法 取生长状态良好的C6胶质瘤细胞悬液，按1 × 107个细胞/25 μl的密度接种于20只SD大鼠腹股沟区皮下，观察其生长情况。将16只成瘤大鼠随机等分为治疗组与非治疗组，前者按相同剂量隔日腹腔内注射BCNU。治疗2周后处死全部大鼠，取大鼠右侧腹股沟区皮下肿瘤行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色，检测胶质瘤的病理学特征及胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、bax和bcl-2蛋白的表达情况，观察瘤细胞凋亡情况。 结果 C6胶质瘤细胞皮下接种4~5 d后，大鼠腹股沟区皮下形成实体瘤;治疗2周，非治疗组和治疗组SD大鼠平均肿瘤质量差异有统计学意义 (P <0.01)，治疗组肿瘤抑制率为29.6%。肿瘤GFAP表达为阳性;BCNU治疗后bax基本无改变，bcl-2下调明显 (P <0.01)，bax/bcl-2比值明显增加。 结论 BCNU腹腔注射治疗大鼠神经胶质瘤导致胶质瘤细胞凋亡，其主要机制可能与下调凋亡蛋白bcl-2的表达和升高bax/ bcl-2的比值有关。

　　【关键词】 神经胶质瘤 卡莫司汀 基因 bax 基因 bcl-2 细胞凋亡

　　Mechanism of C6 glioma cell apoptosis induced by carmustine

　　WANG Xin, YANG Zhiyong, WANG Tinghua

　　Department of Neurosurgery, First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, China; Institute of Neuroscience, Kunming Medical College, Kunming 650031, China

　　Abstract： Objective To investigate the apoptosis-inducing effect of carmustine (BCNU) on C6 glioma cells and its mechanism. Methods C6 glioma cell suspension was inoculated into the subcutaneous tissue in the iliac region in 20 SD rats each with 1 × 107 cells/25 μl, and the growth of the rats was observed. Sixteen tumor-bearing rats were randomly and equally divided into treatment group and non-treatment group, and carmustine was injected into abdominal cavity with the same dose in treatment rats. Two weeks later, all SD rats were sacrificed. HE staining and immunohistochemistry were performed to detect the pathological features of glioma and the expression of GFAP, bax/bcl-2 protein to observe the apoptosis of the tumor cells. Results 4-5 days after C6 glioma cells were transplanted, subcutaneous solid tumors formed in the inguinal region of the rats. The weight of the tumor showed a significant difference between the two groups (P < 0.05). The tumor control rate was 29.6% in the treatment group. The GFAP expression was positive, and the expression of bcl-2 protein was dramatically downregulated by BCNU (P < 0.01), whereas there were no obvious influence on the expression of bax protein, with the ratio of bax/bcl-2 obviously increased. Conclusion The mechanism of apoptosis induced by BCNU might be related to its down-regulating the expression of bcl-2 protein and up-regulating the ratio of bax/bcl-2.

　　Key words: glioma; Carmustine; gene, bax; gene, bcl-2; apoptosis

　　卡莫司汀 (BCNU) 是目前临床上应用最广泛的胶质瘤化疗药物，因其具有较小的分子量和良好的脂溶性，因此能够透过血-脑屏障[1]。目前对其引起胶质瘤细胞凋亡的作用机制尚不明确。本研究采用C6胶质瘤接种于SD大鼠皮下，制作大鼠皮下胶质瘤动物模型，再选用皮下接种胶质瘤成功的SD大鼠为研究对象，通过苏木精-伊红染色、免疫组化技术研究BCNU对胶质瘤凋亡的作用机制，为临床进一步了解和应用BCNU提供参考。

　　1 对象与方法

　　1.1 实验动物 成年Sprague-Dawley (SD) 雌性大鼠25只，体质量180~200 g，由昆明医学院动物科提供。

　　1.2 实验仪器、主要试剂及其配制 大鼠C6胶质瘤细胞株由昆明医学院神经科学研究所细胞室提供。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶 (Gibco)。胎牛血清 (FBS) 由杭州四季青公司生产。兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 单克隆抗体 (Chemicon)，兔抗鼠单克隆抗体bax-IgG和兔抗鼠多克隆抗体IgG (Santa Cruz)。两步法免疫组织化学检测系统 (北京中杉)，BCNU注射剂 (天津金耀)。

　　1.3 细胞培养和荷瘤鼠皮下模型的建立 常规复苏大鼠C6胶质瘤细胞于RPMI 1640培养基中，加入10%FBS，置于含5%二氧化碳的37 ℃培养箱中培养。将25只雌性SD大鼠随机分为两组：实验组20只，对照组5只。选择对数生长期细胞消化，计数细胞总数后，调整细胞悬液终浓度至1 × 107/25 μl，接种于SD大鼠右侧腹股沟区皮下;对照组用RPMI 1640培养基代替C6胶质瘤细胞悬液。

　　1.4 实验动物分组 C6胶质瘤细胞和RPMI1640培养基接种后，同一条件下常规喂养，每日观察肿瘤生长情况。将肿瘤生长满意 (呈球形或椭圆形，直径10 mm左右) 的大鼠作为实验模型。符合条件者16只，随机分成2组，每组8只。治疗组注射BCNU 21 mg/kg，将BCNU以生理盐水稀释，配制成2.5 mg/ml，隔日腹腔给药，持续2周;非治疗组注射相同剂量的生理盐水。

　　1.5 肿瘤称重、动物生存分析和组织病理学检查 治疗大鼠2周后，所有大鼠均采用3.6%水合氯醛溶液 (1 ml/100 g) 行腹腔注射麻醉，灌注处死大鼠后，立即剥离取出瘤块，剔除包膜、带血的组织和其他组织，电子天平称重。肿瘤抑制率 = (非治疗组平均瘤重-治疗组平均瘤重) /非治疗组平均瘤重 × 100%。随后进行SD大鼠的灌注、取材、冷冻切片，切片厚度10 μm，行苏木精-伊红染色，观察C6胶质瘤的组织病理学特征。

　　1.6 肿瘤组织的免疫组织化学染色 肿瘤组织冷冻切片后按常规方法行免疫组织化学实验，分别检测GFAP和bax、bcl-2蛋白在大鼠肿瘤组织中的表达情况 (光学显微镜下细胞膜和细胞质染色者为阳性细胞，每张切片选取10个视野，高倍镜下计数各组阳性细胞数)，计算凋亡细胞百分率。

　　1.7 统计学处理　　 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。所有实验数据用x ± s 表示，采用两组独立样本的t检验进行统计学分析，P <0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 BCNU对荷瘤鼠治疗的结果 16只荷瘤大鼠均未见死亡，治疗组大鼠肿瘤体积较非治疗组小，差异显著 (P <0.01)，肿瘤抑制率为29.6% 。

　　2.2 大体病理学观察 非治疗组荷瘤大鼠肿瘤韧性明显，表面无坏死，肿瘤呈新鲜鱼肉状，血供丰富。不同时限治疗组之间、同时限治疗组与非治疗组之间，肿瘤内部发生坏死、囊性变等病理学改变的情况均存在较大差异。治疗组肿瘤有假包膜形成。

　　2.3 光学显微镜观察 非治疗组肿瘤细胞呈圆形、梭形或多角形，肿瘤细胞排列紊乱，细胞核呈圆形或不规则形，染色质深染，核分裂相多见，细胞质较少，略嗜伊红，细胞间质少见，中心部位由于肿瘤生长过快可见坏死。治疗组肿瘤细胞形态与对照组相近，但镜下死亡细胞较非治疗组增多，瘤内出血坏死更加显著。

　　3 讨论

　　神经胶质瘤在颅内肿瘤中发病率最高，肿瘤呈浸润性生长。C6胶质瘤细胞来源于N-亚硝基脲 (N-methylnintrosourea) 诱导的大鼠脑星形胶质细胞[2-3]，与大鼠脑组织兼容性好，成瘤率高且肿瘤生长快，与人脑胶质母细胞瘤病理特征一致，具有与自发生长的脑胶质瘤一样的生长和浸润特征，且有血管增生，是建立大鼠胶质瘤模型的理想细胞。本实验以C6胶质瘤细胞作为移植细胞，建立SD大鼠皮下胶质瘤模型，建立的皮下胶质瘤特异性表达胶质细胞特异性标记物GFAP[4]，具有人脑神经胶质瘤的基本特性，可以很好地用于胶质瘤治疗的体内研究。

　　BCNU是临床上常用的，也是胶质瘤术后首选的化疗药物[5]。由于其副作用大，临床很少单独应用。目前，BCNU对胶质瘤细胞凋亡作用的机制尚不十分明确。细胞的凋亡调节蛋白包括抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，正常情况下两者之间的平衡决定了细胞生存与死亡的趋向。bax和bcl-2是最具有代表性的促进凋亡和抑制凋亡的基因[6]。凋亡的终止依赖于促凋亡与抑凋亡因子的比例[7]，bax 通过抑癌基因p53 转录激活，是凋亡过程关键的调节因子[8]。bax 蛋白与bcl-2蛋白的比值起着控制细胞凋亡的作用[1，9]，因此，bax/bcl-2比值可反映凋亡的平衡体系。

　　本实验分别检测治疗组与非治疗组大鼠胶质瘤中bax和bcl-2蛋白的表达情况，发现治疗组大鼠肿瘤组织中bcl-2蛋白的表达较非治疗组明显减少，两者之间差异有统计学意义 (P <0.05);而bax蛋白的表达在两组之间差异无统计学意义 (P >0.05);bax/bcl-2比值明显增加。这与Lytle等[10]报告的体外实验结果相符。另外，治疗组胶质瘤组织较非治疗组明显减小，瘤内出血坏死亦较非治疗组显著;该结果与免疫组化结果相吻合。

　　因此，通过大鼠的体内实验我们认为：BCNU主要通过使bcl-2蛋白表达阳性率下降而上调bax/bcl-2的比值，从而使胶质瘤细胞发生凋亡;而bax蛋白表达并无明显增加。

　　本实验进一步证明了腹腔注射BCNU能够对大鼠体内接种的C6胶质瘤产生明显的促进肿瘤细胞凋亡作用。在此基础上，我们可以考虑将BCNU促肿瘤细胞凋亡作用作为药物化疗的目标，配合有效的手术、放疗，来进一步研究胶质瘤的治疗方案。由于单药化疗副作用是显著的，因此，我们应该向着增加肿瘤细胞凋亡和减少化疗药物副作用的方向不断努力。

　　【参考文献】

　　[1] XU X, CHEN X, XU X, et al. BCNU-loaded PEG-PLLA ultrafine fibers and their in vitro antitumor activity against Glioma C6 cells [J]. J Control Release, 2006, 114(3): 307- 316.

　　[2] WATANABE K, SAKAMOTO M, SOMIYA M, et al. Feasibility and limitations of the rat model by C6 gliomas implanted at the subcutaneous region[J]. Neurol Res, 2002, 24(5): 485-490.

　　[3] PETERSON D L, SHERIDAN P J, BROWN W E JR, et al. Animal models for brain tumors: historical perspectives and future directions [J]. J Neurosurg, 1994, 80(5): 865-876.

　　[4] MOORE X L, LU J, SUN L, et al. Endothelial progenitor cells "homing" specificity to brain tumors [J]. Gene Ther, 2004, 11(10): 811-818.

　　[5] LI Y, HO-DUC H L, TYLER B, et al. In vivo delivery of BCNU from a MEMS device to a tumor model [J]. J Control Release, 2005, 106(1-2): 138-145.

　　[6] GUO B, ZHAI D, CABEZAS E, et al. Human in peptide suppresses apoptosis by interfering with Bax activation [J].Nature, 2003, 423 (6938): 456-461.

　　[7] LI X, MARANI M, YU J, et al. Adenovirus-mediated Bax overexpression for the induction of therapeutic apoptosis in prostate cancer [J]. Cancer Res, 2001, 61(1): 186-191.

　　[8] LEE A, DE-JONG G, GUO J, et al. Bax expressed from a herpes viral vector enhances the efficacy of N, N'-bis(2- hydroxyethyl)-N-nitrosourea treatment in a rat glioma model [J]. Cancer Gene Ther, 2000, 7(8): 1113-1119.

　　[9] KORSMEYER S J. BCL-2 gene family and the regulation of programmed cell death [J]. Cancer Res, 1999, 59(7 Suppl):1693-1700.