帕金森病模型大鼠杏仁基底外侧核神经元电活动的研究

　　作者：吴仲恒，张巧俊，刘健，向莉，王涛 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院神经内科，陕西西安 710004;2. 生理学与病理生理学系，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 观察单侧黑质纹状体通路毁损后杏仁基底外侧核(basolateral nucleus of amygdala, BLA)投射神经元电活动的变化。方法 应用6-羟多巴胺单侧毁损黑质致密部建立帕金森病(Parkinsons disease, PD)大鼠模型。采用玻璃微电极细胞外记录法，记录BLA投射神经元的电活动。结果 对照组和PD组大鼠BLA投射神经元的放电频率分别是(0.66±0.13)Hz(0.08-2.73 Hz, n=25)和(0.46±0.1)Hz(0.08-2.34 Hz, n=24)，PD组大鼠的放电频率较正常组降低，但无统计学差异(P>0.05)。对照组大鼠96%的BLA投射神经元呈现爆发式放电，4%为不规则放电;PD组大鼠90%的投射神经元显示爆发式放电，10%为不规则放电。PD组大鼠BLA投射神经元的放电形式与对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论 帕金森病大鼠BLA投射神经元的放电频率和放电形式未发生改变。

　　【关键词】 帕金森病 6-羟多巴胺 杏仁基底外侧核 电生理学

　　Study on the neuronal activity of basolateral nucleus of amygdalain a rat model of Parkinsons disease

　　Wu Zhongheng, Zhang Qiaojun, Liu Jian, Xiang Li, Wang Tao

　　(1. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Physiology and Pathophysiology,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the changes in neuronal activity of projection neuron in the basolateral nucleus of amygdale (BLA) after the unilateral lesion of the nigrostriatal pathway. Methods The rat model of Parkinson's disease (PD) was established by 6-hydroxydopamine lesion of the substantia nigra pars compacta, and then the spontaneous discharge of projection neuron of the BLA was examined with extracelluar recording methods in control and PD rats. Results The results showed that the firing rates of projection neurons of the BLA were (0.66±0.13)Hz (0.08-2.73 Hz; n=25) and (0.46±0.1)Hz (0.08-2.34 Hz; n=24) in control and PD rats, respectively. The firing rates of the neurons in PD rats did not reach significant level compared to those of the control rats (P>0.05). In control rats, 96% of projection neurons of the BLA were discharged in bursts and 4% irregularly. In PD rats, 90% of projection neurons of the BLA had a bursting firing pattern and 10% irregularly. The distribution of firing patterns of the neurons in PD rats did not differ from that of the control rats (P>0.05). Conclusion The present data suggest that the degeneration of the nigrostriatal pathway did not cause changes in firing rates and firing pattern of projection neurons of the BLA in the rats.

　　KEY WORDS: Parkinsons disease; 6-hydroxydopamine; basolateral nucleus of amygdala; electrophysiology

　　帕金森病(Parkinsons disease, PD)是一种进行性的神经系统变性疾病，主要病理变化是黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神经元的退行性变性，其临床症状主要为静止性震颤、肌强直和运动迟缓等。但是PD的病理改变不局限于黑质纹状体多巴胺能系统，研究发现在PD患者和动物也有边缘系统形态或(和)功能的变化。磁共振和尸检发现PD患者的杏仁核和海马的体积缩小，反映出这些结构中的神经元减少和路易氏体形成[1]。约有40%的PD病人有抑郁症的表现，并且抑郁表现可在运动系统症状之前出现[2]。此外，部分患者亦有焦虑和痴呆。基底外侧杏仁核(basolateral nucleus of amygdale, BLA)是边缘系统的一个重要结构，它由兴奋性的投射神经元和抑制性的中间神经元组成，BLA与情感性活动、学习与记忆等脑功能活动密切有关[3]。然而，BLA神经元的活动与帕金森病发病关系未见相关报道。因此，本研究以6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)损毁SNc的PD模型大鼠为对象，采用电生理学方法，观察BLA投射神经元放电频率和放电形式的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物和药品

　　实验选用健康雄性Sprague-Dawley大鼠35只，体重250-350 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。大鼠在标准环境中饲养，室温20-25 ℃，24 h昼夜循环光照，自由摄食饮水。预养1周后，随机分为2组：对照组19只和PD组16只。实验所用药品6-OHDA、阿朴吗啡以及地昔帕米均购自美国Sigma公司。

　　1.2 帕金森病大鼠模型的建立

　　采用6-OHDA化学性损毁SNc的多巴胺能神经元。6-OHDA溶于含0.1 g/L的抗坏血酸生理盐水中(2 μg/μL)，用前配制，避光保存。制作帕金森大鼠模型前30 min腹腔注射地西帕明(25 mg/kg)以保护去甲肾上腺素能神经元。然后经腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，将大鼠头部固定于立体定位仪上。根据Paxinos-Watson大鼠脑定位图谱确定右侧SNc的位置：AP -5.0-5.3 mm，L 1.9-2.1 mm，D 7.2-7.4 mm[4]。将10 μL微量注射器与玻璃微电极相连，电极尖端直径约50 μm，分两个位点在SNc注射6-OHDA，每点2 μL(4 μg)，总量4 μL(8 μg)，注射完毕后留针5-10 min，缓慢退针。6-OHDA注射后1周，给大鼠颈部皮下注射阿朴吗啡(0.05 mg/kg)，10 min后诱发向健侧旋转每5 min大于20转者，表明PD模型成功，列为实验对象[5]。

　　1.3 电生理记录

　　电生理记录在SNc损毁后第3周进行。大鼠经腹腔注射乌拉坦(1.2 g/kg)麻醉，行气管插管和颈外静脉插管术，将其头部固定于脑立体定位仪上，依据Paxinos-Watson大鼠脑定位图谱确定BLA的位置，坐标为：AP -2.0-2.8 mm，L 4.8-5.0 mm，D 6.5-7.4 mm[4]。采用玻璃微电极细胞外记录法记录BLA神经元放电，电极尖端直径1-2 μm，阻抗10-20 MΩ，充灌液为0.5 mol/L醋酸钠(内含20 g/L的滂胺天蓝)。细胞放电信号经微电极放大器显示于记忆示波器上，将信噪比大于3∶1的、稳定的单细胞电活动经生物电信号采集与分析系统(CED1401 Spike2)导入计算机后，做实时观察、储存并进行频率及放电形式的分析。整个实验过程中监测大鼠的心电，直肠温度维持在(37±0.5)℃。

　　1.4 放电形式分析

　　根据放电间隔图(interspike interval histogram, ISIH)和相关的几个参数鉴别神经元的放电形式。每一神经元ISIH的生成至少包含500个动作电位，bin宽4 ms。依据该图将神经元的放电形式分为：①规则放电，ISIH呈对称性分布;②不规则放电，ISIH为随机分布;③爆发式放电，ISIH呈明显的逐渐衰减的正偏态分布。从ISIH中我们还测量和计算了众数(mode)、不对称指数(asymmetry index)和变异系数(coefficient of variation)，以协助判断神经元的放电形式。众数指最高频率的放电间隔(interspike interval, ISI);不对称指数为众数与平均ISI的比值，反映ISIH的形状，该值小于1表示正偏态分布，表明大部分是短放电间隔，可能是爆发式的放电活动;变异系数是ISI的标准差与平均ISI之比，反映神经元活动的规律性[5]。

　　1.5 组织学定位

　　电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳膀胺天蓝标记最后一个记录位点(-20 μA，15 min)。大鼠在过量麻醉下，经心脏灌注生理盐水100 mL，随后用40 g/L多聚甲醛150 mL灌注固定;取脑，后固定4 h;40 μm冠状冰冻切片，尼氏染色以确定膀胺天蓝标记点的位置。

　　1.6 统计学分析

　　统计学分析采用SPSS13.0软件，所有数据采用±s表示。组间计量资料的比较采用独立样本t检验，放电形式的比较均采用χ2检验，反映放电形式参数的比较采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　PD组大鼠在皮下注射阿朴吗啡后向损毁侧对侧的旋转圈数为(45±4)/5 min;对照组及PD组大鼠所有的电生理记录位点均位于BLA内(图1)，实验所观察的BLA神经元的波宽均大于2.5 ms，符合BLA投射神经元的标准[6]。实验记录并分析了对照组BLA25个神经元及PD组24个神经元的电活动。放电频率分别为对照组(0.66±0.13)Hz(0.08-2.73 Hz)和PD组(0.46±0.1)Hz(0.08-2.34 Hz)，PD组大鼠的放电频率较对照组降低，但无统计学差异(P>0.05，图2)。对照组和PD组大鼠BLA投射神经元的平均ISI分别是(3.67±0.66)s和(4.38±0.65)s，两组间无明显差异(P>0.05，表1)。根据ISIH所做的放电形式分析，对照组大鼠96%的BLA投射神经元呈现爆发式放电，4%为不规则放电;PD组大鼠的BLA投射神经元呈现爆发式和不规则放电的比例分别为90%、10%(图3A-图3B)。2组大鼠BLA投射神经元放电形式的分布没有统计学差异(P>0.05，图3C)。反映放电形式的参数众数、不对称指数和平均ISI的变异系数在2组间均没有明显差异(表1)。

　　3 讨论

　　本实验采用细胞外记录法观察了正常大鼠和6-OHDA损毁SNc的PD大鼠BLA投射神经元的电活动变化，目前国内外尚未见相关报道。研究结果表明6-OHDA损毁后3周大鼠BLA投射神经元的放电频率和放电形式没有改变。

　　BLA是边缘系统中杏仁核复合体主要接受传入纤维的亚核团，由谷氨酸能的投射神经元和在局部发挥抑制作用GABA能中间神经元组成。来自皮质、丘脑、SNc、腹侧被盖区和中缝背核在此均有纤维投射[7-9]，这些传入纤维释放不同的神经递质、通过不同的受体调节BLA神经元的活动。此外，BLA内部GABA中间神经元的轴突具有广泛的分支，并与投射神经元形成突触联系，通过复杂的局部环路影响BLA投射神经元的活动[9]。因此，BLA神经元的活动受到复杂的内在和外在因素的调节。

　　BLA接受来自SNc和腹侧被盖区的多巴胺能纤维投射，且表达多巴胺D1和D2受体 [7]。体循环和局部应用多巴胺受体激动剂降低BLA投射神经元的放电频率，而增加中间神经元的电活动。此外，通过电刺激SNc和腹侧被盖区在BLA也产生和体循环应用多巴胺受体激动剂类似的效应。研究还发现BLA多巴胺受体的激活降低投射神经元的活动是通过直接的抑制作用和间接作用于中间神经元而产生的。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢基吡啶诱发的PD小鼠，BLA中酪氨酸羟化酶阳性纤维的密度降低约20%，黑质纹状体通路变性导致SNc多巴胺能纤维投射区的多巴胺和多巴胺的代谢产物显著降低[10]。因此，SNc损毁后引起BLA中投射神经元的活动增强和中间神经元的活动降低。前额叶皮质和感觉联合区皮质接受来自腹侧被盖区的多巴胺能投射，多巴胺通过直接和间接作用影响皮质锥体神经元的活动。在体细胞内记录研究发现局部应用多巴胺和刺激腹侧被盖区抑制皮质锥体神经元的活动。刺激内侧前额叶皮质兴奋BLA中间神经元，进而抑制投射神经元的活动;感觉联合区皮质的兴奋增加BLA投射神经元的活动。SNc的损毁降低了前额叶皮质的多巴胺含量，并引起D1和D2受体表达下调[11]，这些变化降低了内侧前额叶皮质的兴奋性谷氨酸能传出对BLA中间神经元的影响，以及感觉联合区的兴奋性传出对投射神经元的作用。此外，丘脑的背内侧核也发出谷氨酸能纤维到BLA，但是它对BLA神经元的影响目前尚不清楚。

　　除受上述多巴胺能及谷氨酸能作用影响外，BLA还接受来自中缝背核的5-羟色胺能纤维的支配，并且多种5-羟色胺受体亚型。局部给予5-羟色胺后，虽然杏仁核神经元产生兴奋、抑制和无变化3种形式的反应，但多数神经元的活动被抑制[12]。神经化学研究证实PD患者基底神经节、杏仁核、皮质和脑脊液中5-羟色胺和5-羟色胺的代谢产物5-羟乙哚乙酸显著降低[12]，尸检发现PD患者中脑缝核5-羟色胺能神经元丢失50%，并且PD患者中脑缝核5-羟色胺1A受体的结合力显著降低[13-14]。研究还发现PD患者和动物的中缝背核、杏仁核和海马5-羟色胺1A受体密度降低，而在PD患者的前额叶皮质突触后5-羟色胺1A受体表达增多[14]。这些研究证实黑质纹状体通路变性导致中脑缝核5-羟色胺系统严重受损。5-羟色胺1A受体是G蛋白耦合受体，它的激活促进K+内流而抑制神经元的活动。根据上述及本研究结果分析，杏仁核5-羟色胺含量的降低和5-羟色胺1A受体密度的降低将增加BLA神经元的活动，而前额叶皮质5-羟色胺1A受体表达的增多将导致BLA中间神经元活动增强，从而导致投射神经元活动的降低。

　　BLA投射神经元的活动受传入神经纤维以及局部环路的复杂调节，其神经元的放电频率和放电形式在SNc损毁后未发生明显的改变，可能的机制是兴奋性和抑制性作用在BLA投射神经元上达到了平衡。本实验从黑质纹状体之外的边缘系统角度入手，为帕金森发病机制研究提供了新思路。

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