rhEPO对局灶性脑缺血再灌注脑损伤保护机制的研究

　　作者：周铁柱 王薇 胡晓颖 陈雪 作者单位：中国医科大学第四医院神经内科，辽宁 沈阳 110032

　　【摘要】目的 观察rhEPO对缺血性卒中脑海马区不同时间点S100B蛋白表达的动态变化，研究rhEPO对局灶性脑缺血再灌注损伤影响的可能机制。方法 取66只SD大鼠建立局灶性脑缺血再灌注(I/R)模型，随机分成假手术对照组(n=6)、脑I/R组(n=30)、rhEPO治疗组(n=30)，按再灌注时间分为5个亚组，每个亚组6只(6 h组、12 h组、1 d组、3 d组、7 d组)，缺血2 h后开始再灌注。免疫组化法检测缺血不同时间各组脑海马缺血中心和周围区S100B蛋白，原位末端标记技术检测各组脑海马缺血中心和周围区神经细胞凋亡。结果 脑I/R损伤组与假手术对照组比较细胞凋亡数明显增多(P<0.05)，rhEPO治疗组与脑I/R组相比，凋亡细胞数明显减少(P<0.05);免疫组化检测结果显示，I/R组与假手术对照组相比，S100B蛋白表达明显增加(P<0.05)，rhEPO治疗组与脑I/R组相比，S100B蛋白表达明显减少(P<0.05)。 结论 rhEPO可能通过减少S100B蛋白表达、抗凋亡对局灶性脑缺血I/R产生保护作用。

　　【关键词】 EPO;脑缺血;再灌注脑损伤;凋亡

　　近来研究发现，重组人红细胞生成素(rhEPO)对脑缺血再灌注损伤(I/R)具有神经保护作用〔1〕，S100B蛋白是神经胶质细胞分泌的蛋白质，是反映神经细胞损伤的标记物，目前国内外缺少给予rhEPO后脑缺血灌注区S100B蛋白动态观察的相关报道。为进一步探讨rhEPO对缺血性脑损伤产生保护作用的机制，本文观察了大鼠局灶性脑缺血再灌注后腹腔内注射rhEPO 后大鼠海马区S100B蛋白表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　健康Wistar大鼠66只，雄性，体重250～280 g，中国医科大学实验动物中心提供。10%水合氯醛、SABC试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒、DAB显色剂(武汉博士德);rhEPO (沈阳三生制药股份有限公司);抗S100B抗体、尼龙线直径2.3 mm(日本伊东公司);Olympus实体显微镜、计算机图像分析软件(Metamorph Imaging System)(中国医科大学实验技术中心)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型制备及分组

　　采用ZeaLonga〔1〕的大脑中动脉线栓法并加以改进，制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，动物仰卧位固定于手术台上，颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，结扎ECA及CCA，在CCA分叉处剪一切口，将尼龙线栓子经CCA和ICA进入到大脑中动脉起始部，阻断右侧大脑中动脉，尼龙线栓子插入的深度距ICA和ECA分叉处为(20±0.5)mm，扎紧ICA处的备用线。假手术对照组除不插入栓子外其余同实验组，手术中和手术后维持动物体温在37℃左右，缺血2 h后，拔出栓子2 mm，使血液再灌注，成功后假手术对照组及缺血组分别腹腔内注入0.3 ml生理盐水，治疗组腹腔内注入rhEPO(4 000 U/kg)0.3 ml(1 000 U)，按不同缺血时间断头,取脑组织。该模型成功的标志：右侧Horner征，左侧出现以前肢为重的偏瘫。实验分3组：假手术对照组6只;I/R组及rhEPO治疗组，每组30只，均为脑缺血2 h再灌注6、12 h、1、3、7 d处死，每个时间点6只。

　　1.2.2 免疫组化染色检查

　　各组大鼠至指定时间点处死后断头取脑，取前囟前后1 mm脑组织，常规固定、石蜡包埋、每隔100 μm连续冠状切片(厚6 μm)，进行免疫组化染色检测S100B蛋白的表达情况。显微镜下观察海马细胞胞浆有棕褐色颗粒者为阳性细胞。

　　1.2.3 TUNEL原位凋亡染色法检测细胞凋亡

　　按照原位TUNEL试剂盒说明书对各组大鼠脑组织切片进行凋亡染色，细胞核中出现棕褐色颗粒者为阳性细胞。

　　1.3 统计学处理

　　每张切片中采集海马4个高倍视野，其中每个视野中细胞总数不少于100个。所测数据以x±s表示，组间比较采用SPSS13.0软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组S100B蛋白表达

　　脑I/R损伤组与假手术对照组相比，S100B蛋白表达明显增加(P<0.05)，rhEPO组较脑I/R组S100B蛋白表达明显减少(P<0.05)，见表1、图1。表1 不同脑I/R时间点各组大鼠海马S100B蛋白表达(略)

　　2.2 神经细胞凋亡情况

　　脑I/R组与假手术对照组比较神经细胞凋亡数明显增多(P<0.05)，rhEPO组较缺血再灌注损伤组比较神经细胞凋亡数明显减少(P<0.05)，见表2、图2。表2 不同脑I/R时间点各组海马细胞凋亡数(略)

　　3 讨 论

　　红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种酸性糖蛋白，对红细胞的生成起促进作用，自从rhEPO上市，许多研究已表明EPO对脑缺血有神经保护作用，作用机制目前有几种理论：Morishida等〔2〕认为EPO是通过激活Ca2+通道和MAPK通路来诱发各种神经反应，如保护神经元对抗谷氨酸盐的毒性、多巴胺的释放和NO的合成;Sakanaka等〔3〕认为EPO通过增加神经元内抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶(SOD) 等保护脑实质免受缺血性损伤;Yamaji等〔4〕提出EPO可调节缺血脑区的血管生成，因此增加缺血及邻近区域的脑血流量和组织氧合量;Calapai等〔5〕认为EPO可能通过减少NO介导的自由基形成或通过对抗他们的毒性来发挥神经保护作用;Digicaylioglu等〔6〕证实EPO与其受体结合引发了JAK2激酶的活化，导致核因子κB抑制剂的磷酸化，继而核因子κB从胞浆移位到胞核，诱导神经保护基因的转录，从而起到神经保护作用;EPO控制神经珠蛋白的合成，神经珠蛋白是一种主要在脑内表达的新发现的珠蛋白，有携带氧的作用,EPO可能通过这种机制来增加神经细胞对氧的摄取和利用〔7〕;Vairano等〔8〕发现EPO能改变Bcl/Bax基因表达的比率，使Bcl mRNA水平升高，Bax mRNA水平降低，产生抗细胞凋亡的作用。

　　本实验显示，腹腔内注射rhEPO可以明显减少凋亡细胞数和S100B蛋白表达，说明rhEPO能明显减少I/R造成的神经细胞凋亡，提示局灶性脑缺血时腹腔内注射IGF2对神经元的保护作用可能与减少凋亡细胞的产生、S100B蛋白表达有关。rhEPO的脑保护作用目前尚处在动物实验阶段，不同给药途径、给药剂量、缺血时间、再灌注时间等因素都会对此产生影响，具体机制尚有待于进一步探讨。

　　【参考文献】

　　1 Zea Longa E，Weinstein PR，Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without crainiectomy in rat〔J〕.Stroke，1989;20(1):8491.

　　2 Morishida E，Masuda S，Nagao M,et al.Erythropoietin receptor is expressed in rat hippocampal and cerebral cortical neurons end erythropoietin prevents in vitro glutamateinduced neuronal death〔J〕. Neuroscience，1997;76(1):10516.

　　3 Sakanaka M，Wen TC,Matsuda S,et al.In viro evidence that erythropoietin protects neurons from ischemic damage〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998;95(8):463540.

　　4 Yamaji R，Okada T,Moriya M,et al.Brain capillary endothelial cells express two forms of erythropoietin receptor mRNA〔J〕.Eur J Biochem,1996;239(2):494500.

　　5 Calapai G，Marciano MG，Gorica F,et al.Erythropoietin protects against brain ischemic injury by inhibition of nitric oxide formation〔J〕.Eur J Pharmacol，2000;401(3):34956.

　　6 Digicaylioglu M，Lipton SA.Erythropoietin mediated neuropmtection involves crosstalk between JAK2 and NFKappaB signaling cascedes〔J〕. Nature，2001;412(6847):6417.

　　7 Gonzalez FF,Abel R,Almli CR,et al.Erythropoietin sustains cognitive function and brain volume after neonatal stroke〔J〕.Dev Neurosci，2009;31(5):40311.

　　8 Vairano M，DalloRusso C，Pozzoli G,et al.Erythropoietin exerts antiapoptotic effects on rat microglial cells in vitro〔J〕.Eur J Neurosci,2002;16(4):58492.