转化生长因子β1基因RNAi质粒载体的构建与鉴定

　　作者：王翔，胡治平，周为军，汤建光，卢 伟，唐湘祁 作者单位：1. 中南大学湘雅二医院神经内科，湖南长沙 410011;2. 湘乡市第一人民医院神经内科，湖南湘乡 411400

　　【摘要】 目的 构建人转化生长因子β1(TGFβ1)基因RNAi质粒载体。方法 根据人TGFβ1 mRNA序列选择3个靶序列并设计合成相应3对寡核苷酸序列，同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连入pRNAU6.2/Lenti质粒并分别命名为pRNAU6.2/Lenti1、pRNAU6.2/Lenti2、pRNAU6.2/Lenti3、pRNAU6.2/Lenti4。酶切和测序鉴定后，将以上重组质粒转染Hela细胞，运用RTPCR和ELISA检测TGFβ1 mRNA和蛋白的表达水平。结果 酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNAU6.2/Lenti质粒;与对照组相比，pRNAU6.2/Lenti1、pRNAU6.2/Lenti2转染Hela细胞后，TGFβ1 mRNA水平及蛋白水平的表达量均受到明显抑制;其中TGFβ1蛋白水平在pRNAU6.2/Lenti1组下降79.2%，在pRNAU6.2/Lenti2组下降53.7%，统计有显著性差异(P<0.01)。结论 成功构建了人TGFβ1基因RNAi质粒载体，对于TGFβ1高表达疾病的基因治疗奠定了基础。

　　【关键词】 RNAi;转化生长因子β1;质粒载体

　　interference of transforming growth factorβ1 geneWANG Xiang1, HU Zhiping1, ZHOU Weijun2, TANG Jianguang1, LU Wei1, TANG Xiangqi1

　　(1. Department of Neurology, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011;

　　2. Department of Neurology, the First Peoples Hospital of Xiangxiang City, Xiangxiang 411400, China)ABSTRACT: Objective To construct a plasmid vector of RNA interference (RNAi) of transforming growth factorβ1 gene (TGFβ1). Methods First three target sequences were selected according to TGFβ1 mRNA sequence firstly, then three pairs of oligonucleotide sequences and one pair of negative control oligonucleotide sequence were designed and synthesized. The annealed oligonucleotide fragments were subcloned into pRNAU6.2/Lenti plasmid, which was then named pRNAU6.2/Lenti1, pRNAU6.2/Lenti2, pRNAU6.2/Lenti3 and pRNAU6.2/Lenti4, respectively. After being identified by restriction enzyme digestion and sequencing, the recombinant plasmids were transfected into Hela cells. TGFβ1 expression in the transfected cells was assayed by RTPCR and ELISA. Results Enzyme digestion and DNA sequencing showed that the oligonucleotide fragments were correctly inserted into pRNAU6.2/Lenti plasmid, and TGFβ1 expression in the transfected cells was knocked down significantly by pRNAU6.2/Lenti1 and pRNAU6.2/Lenti2 at both the protein and mRNA level compared with those in the control group. TGFβ1 protein was reduced by a percentage of 79.2% and 53.7% in pRNAU6.2/Lenti1 and pRNAU6.2/Lenti2 group, respectively, which was significantly different from that in the control group (P<0.01). Conclusion The RNAi plasmid vector of TGFβ1 was constructed successfully, which laid foundation for gene therapy for diseases with high TGFβ1 expression.

　　KEY WORDS: RNA interference (RNAi); transforming growth factorβ1 (TGFβ1); plasmid vector

　　转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGFβ1)是TGFβ家族里最主要的亚型，它几乎拥有TGFβ家族所有的生物学功能，在细胞外基质形成、纤维化、局部炎症及肿瘤的发生发展中起重要作用。抑制TGFβ1的表达可以在一定程度上抑制以上疾病。RNA干扰现象是由FIRE等在1998年首先发现的[1]，是指通过正、反义RNA片段形成双链RNA，从而特异性地抑制靶基因转录后表达的现象。作为高效、特异的调节基因表达的技术，RNA干扰已成为基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系研究的有力工具。本研究构建了针对TGFβ1mRNA的质粒干扰载体，将其转染Hela细胞后能高效地抑制TGFβ1的表达，为TGFβ1后续的基因治疗研究奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶(TaKaRa);pRNATU6.2/Lenti质粒载体(GenScript，含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点);Tip100质粒抽提柱(QIAGEN);大小Marker(TaKaRa);Hela细胞(医学遗传学国家重点实验室惠赠);逆转录试剂盒(Promega);TGFβ1 ELISA试剂盒(RnD公司，晶美生物工程有限公司代理);Lipofectamine 2000以及Trizol(Invitrogen);寡核苷酸及引物(上海生物工程有限公司)。

　　1.2 载体的构建及鉴定

　　1.2.1 载体的构建 根据Reynolds等[2]的经验，以人TGFβ1 mRNA序列(GenBank：NM000660)为模板选择3段靶序列，然后根据其中一段靶序列(TTGAACTTGTCATAGATTTCG)设计一段阴性对照序列，此阴性对照序列和靶序列具有相同的组成，但两者mRNA没有同源性;经BLAST表明此4段序列均不与人任何其他cDNA序列同源。再根据以上4段序列分别设计合成4对寡核苷酸序列，每对包含一条正义链(sense)和一条反义链(antisense)(表1);表1中第1、2、3组分别是针对3段靶序列设计的寡核苷酸序列，下划直线标记的部分是靶序列及反义靶序列;第4组是针对阴性对照序列设计的寡核苷酸序列，下划直线标记的部分是阴性对照序列及其反义序列;波浪线标记的是酶切位点，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，CTCGAG为XhoⅠ酶切位点。4对寡核苷酸序列退火后均可形成在5′端含BamHⅠ酶切位点，3′端含XhoⅠ酶切位点，中间含10个碱基发夹环的小片段DNA双链。退火具体步骤为：分别取2μL sense链和antisense链，再加入46μL 1×DNA Annealing Solution，置入PCR仪上经90℃ 3min，37℃ 60min，保存于4℃形成小片段DNA双链。

　　将pRNATU6.2/Lenti质粒用BamHⅠ和XhoⅠ行双酶切，将酶切产物用低熔点琼脂糖胶回收并和上述小片段DNA双链混合，然后经T4DNA连接酶连接过夜。4个重组质粒分别命名为pRNAU6.2/Lenti1、pRNAU6.2/Lenti2、pRNAU6.2/Lenti3和pRNAU6.2/Lenti4，其中pRNAU6.2/Lenti4为阴性对照重组质粒。表1 针对靶序列和阴性对照序列分别设计的寡核苷酸对

　　1.2.2 重组质粒的扩增、鉴定及再扩增 将连接后的重组质粒转化感受态JM109细菌，经含氨苄青霉素培养基筛选后，挑取单克隆扩大培养。按《分子克隆实验指南》，用碱裂解法手工抽提质粒。由于重组质粒仍然含有BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点，所以重组质粒可经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切来初步鉴定，然后用Spin柱试剂盒抽提质粒并通过DNA测序进一步鉴定。

　　1.3 细胞的培养以及重组质粒转染 Hela细胞采用含100mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养液，置于37℃的CO2培养箱中培养。转染实验共分为以下5组：①脂质体组(Lipofectamine 2000,空白对照组);②pRNAU6.2/Lenti1组;③pRNAU6.2/Lenti2组;④pRNAU6.2/Lenti3组;⑤pRNAU6.2/Lenti4组(阴性对照组)。6孔板中细胞汇合度至70%左右时进行转染，具体操作按Lipofectamine 2000说明书进行。转染48h后收集细胞进行后续检测。实验重复3次。

　　1.4 RTPCR半定量检测TGFβ1 mRNA 转染48h后，从6孔板中每组各收集细胞1×106个，采用Trizol一步法抽提总RNA，用逆转录试剂盒进行逆转录反应，然后再行PCR反应。PCR引物及产物大小：TGFβ1正义链为5′GTACCTGAACCCGTGTTGCT3′，反义链为5′GTCCTTGCGGAAGTCAATGT3′，产物长度为486bp;βactin正义链为5′AGCACAGAGCCTCGCCTTT3′，反义链为5′AGGGTGAGGATGCCTCTCTT3′，产物长度为258bp。反应条件为：94℃ 1min，57℃ 45s，72℃ 1min。循环28次。产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳后以BioRad成像系统进行吸光度(A)分析并计算各组A值比。A值比计算公式为：(背景A值-TGFβ1A值)/(背景A值-βactinA值)。

　　1.5 细胞培养液中TGFβ1蛋白质含量的测定(ELISA) 6孔板细胞质粒转染48h后，收集上清，离心后弃沉淀，采用Quantikine，Human TGFβ1 Immunoassay试剂盒(RnD公司，Catalog Number DB100B)，根据试剂盒说明书，梯度稀释成8个不同浓度标准品(分别为0、31.2、62.5、125、250、500、1000、2000ng/L)，再按说明书操作步骤进行，最后在酶标仪上450nm波长测定吸光度值(A)并绘制标准曲线(标准曲线相关系数达0.99以上)。然后检测待测样本在酶标仪上450nm波长A值(以空白孔调零)，根据标准曲线计算各检测样本TGFβ1蛋白浓度，实验重复3次。

　　1.6 统计学处理 用单因素方差分析进行组间差异比较，利用SPSS11.5软件进行统计分析，P<0.05认为组间差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒的鉴定 由于重组质粒仍含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，因此经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后可以获得插入的小片段DNA，大小为76bp，在非变性丙烯酰胺凝胶上清晰可见(图1)，说明目标片段已插入pRNATU6.2/Lenti质粒载体。DNA测序进一步证实目的片段已正确插入pRNATU6.2/Lenti(图2～图5)。

　　2.2 半定量RTPCR 通过Quantity One软件分析可知实验各组间βactin的A值基本一致;TGFβ1的A值在脂质体组、pRNAU6.2/Lenti4组、pRNAU6.2/Lenti3组基本相同，而在pRNAU6.2/Lenti2和pRNAU6.2/Lenti1两组明显降低;进一步分析A值比后可知，脂质体组、pRNAU6.2/Lenti4、pRNAU6.2/Lenti3三组A值比均在0.500左右，相互无显著性差异;而pRNAU6.2/Lenti2、pRNAU6.2/Lenti1两组A值比分别为0.221和0.098，与脂质体组比较有显著性差异(P<0.01，图6、图7)。

　　2.3 ELISA检测Hela细胞上清中TGFβ1蛋白的表达水平 经ELISA检测，Hela细胞中TGFβ1的表达水平与脂质体组比较，pRNAU6.2/Lenti4和pRNAU6.2/Lenti3组蛋白水平无明显变化;而pRNAU6.2/Lenti1和pRNAU6.2/Lenti2组TGFβ1蛋白浓度较脂质体组明显下调(P<0.01)，其中pRNAU6.2/Lenti1组TGFβ1蛋白浓度下调79.2%，pRNAU6.2/Lenti2组TGFβ1蛋白浓度下调53.7%(表2)。图7 实验各组TGFβ1与βactin的吸光度值比

　　3 讨 论

　　TGFβ1可由人体多种细胞及组织生成，分子质量为25ku，由2条分子质量为11ku的含有110～140个氨基酸残基的单链通过二硫键结合而成。TGFβ1能刺激纤维母细胞生长、刺激基质合成、增加细胞外基质的聚集并抑制其降解，因而与器官纤维化及瘢痕形成的发生、发展密切相关[34]。在大多数肿瘤患者尤其是中晚期肿瘤患者体内，可以观察到TGFβ1过表达。过表达的TGFβ1可以抑制机体的免疫功能，帮助肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视;使肿瘤细胞产生对生长抑制的耐受，造成恶性肿瘤的异常增殖;增加肿瘤内血管生成、加强肿瘤细胞与胞外基质的相互作用从而进一步促进肿瘤的侵袭和转移[56]。TGFβ1还与一些较少见的疾病密切相关。ALEXANDER等[7]发现TGFβ1在人巨细胞动脉炎(颞动脉炎)中高度表达，并且对激素治疗耐受。这使巨细胞动脉炎患者在接受治疗数年后仍然存在血管的慢性炎症和内膜增生。由此可见，抑制TGFβ1蛋白的生物学功能将成为治疗以上疾病的必不可少的措施之一。

　　目前，人们已经应用了包括中和抗体在内的一些技术抑制TGFβ1及其信号通路，治疗瘢痕组织的形成等疾病[8]。但是，由于这些技术本身的缺陷，疗效有时还不满意，而近年来进展迅速的RNAi技术的应用为这些疾病的治疗带来了新的曙光。

　　RNAi的本质是由发夹样结构的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)介导的与之同源的mRNA特异性降解，进而抑制其相应基因表达的过程。目前，RNAi已经被广泛应用于传染性疾病、癌症等的研究，结果都证实了RNAi能直接对疾病加以控制的能力[910]。

　　应用RNAi抑制TGFβ1表达的研究国内外也已有报道，但干扰效率最高仅为64%，并不令人满意[1112]。鉴于此，本研究设计了与上述研究不同的3个靶序列，构建了针对TGFβ1mRNA的siRNA表达质粒载体。在设计siRNA时，根据REYNOLDS等[2]的经验，遵循了以下原则：①在起始密码子后的50～100个碱基后进行设计;②siRNA长度设计为21个碱基;③GC含量不超过50%;④避免4个连续的A或者T碱基的序列;⑤避免与人任何其他cDNA序列同源。包含由以上原则设计而来的小片段双链DNA的pRNAU6.2/Lenti质粒载体转染到Hela细胞后，在RNA聚合酶III的作用下，以小片段双链DNA的antisense链为模板，能转录出一个发夹样结构的siRNA。此siRNA与天然的siRNA结构很类似，有利于诱发RNAi。酶切和测序证实合成的小片段双链DNA序列正确并已准确克隆入pRNAU6.2/Lenti质粒载体，将其转染Hela细胞，结果显示pRNAU6.2/Lenti1和pRNAU6.2/Lenti2重组干扰质粒在Hela细胞中对TGFβ1 mRNA和蛋白的表达均有明显的抑制作用，其中pRNAU6.2/Lenti1重组质粒在蛋白水平对TGFβ1的抑制效率达79.2%，明显高于以前的研究，且对βactin表达无明显影响，说明它们的特异性也能得到保证。尽管本实验只是在Hela细胞中证实了上述两重组质粒的有效性和特异性，但由于TGFβ1的高度保守性，其基因结构在不同组织和细胞中高度一致，因此在人体其他不同组织细胞中也能发挥同样的作用。

　　另外，本实验采用的pRNATU6.2/Lenti质粒是GenScript公司新近开发的产品，小片段DNA双链插入该质粒后，无需对此质粒进行改造就可以直接与相应的包装系统共转染293FT细胞生产高滴度的慢病毒干扰载体，因此为器官纤维化及瘢痕形成、肿瘤、巨细胞动脉炎等疾病体内实验的基因治疗提供了便利。

　　【参考文献】

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