新生小鼠耳蜗Corti器的体外培养与观察

　　作者：许涛　,孟秀清，王爱梅　,刘双月　,牟华 作者单位：1.辽宁医学院基础学院生理学教研室,辽宁 锦州 121001;2.辽河油田中心医院神经内科，辽宁　盘锦　124000

　　【摘要】 目的 建立新生昆明小鼠耳蜗Corti器体外培养的简便方法并观察耳蜗毛细胞的组织学形态。方法 取生后3～5 d昆明小鼠耳蜗基底膜，平铺在胶原凝胶表面，然后在含有1% 牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基中进行培养。采用异硫氰酸四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色方法观察耳蜗毛细胞的生长情况。结果 耳蜗基底膜经24、48 h和72 h培养后，内、外毛细胞均生长良好，其结构完整，纤毛束排列有序，无任何缺失。结论 本培养方法简便有效，可用于耳蜗Corti器体外培养实验研究。

　　【关键词】 小鼠;耳蜗;体外培养;Corti器

　　Culture and Observation of the Organ of Corti from Newborn Mouse in VitroXU Tao1,MENG Xiuqing2,WANG Aimei1, LIU Shuangyue1, Mou Hua1(1.Department of Physiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China;2.Department of Newology,Central Hospital of Liaohe Oil Field,Panjin 124000 China)Abstract: Objective To establish an simple method for the culture of the organ of Corti from newborn Kunming mouse, and to observe the histological morphology of cochlear hair cells. Methods The cochleae from Kunming mice of postnatal day 3 to 5 were used. The basilar membrane of the mouse was isolated and positioned on the surface of collagen gel, and then cultured in DMEM / F12 medium containing 1% bovine serum albumin. Tetramethylrhodamine isothiocyanate-labeled phalloidine staining was used to observe growing status of hair cells. Results Following culture of the cochlear basilar membrane for 24 hours, 48 hours and 72 hours, the inner and outer hair cells were both growing well. Their structures were intact, and stereociliary bundles were arranged orderly, without any deletion. Conclusions This method is simple and effective, which can be applied to the experimental study of the organ of Corti in vitro culture.

　　Key words:mouse; cochlea; culture; organ of Corti

　　耳蜗Corti器体外培养是进行内耳生理和病理生理等实验研究的重要手段，尤其对研究各种耳毒性药物的听觉损伤机制及其防治办法具有较大的实际应用价值。目前关于耳蜗Corti器体外培养的方法各不相同，本文介绍一种简便有效的新生昆明小鼠耳蜗Corti器的体外培养方法，并通过异硫氰酸四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)标记的鬼笔环肽荧光染色技术，观察了耳蜗毛细胞的组织学形态。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　选择出生3～5 d的昆明小鼠20 只，雌雄不限，由辽宁医学院实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂和仪器

　　牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA );TRITC-鬼笔环肽(美国Sigma公司);DMEM / F12培养基(美国Hyclone公司);Ⅰ型鼠尾胶(杭州生友公司);10×BME(北京迈晨生物科技有限公司)。CO2培养箱(SANYO);荧光显微镜(ZEISS A1)。

　　1.3 耳蜗基底膜取材

　　将小鼠用75%乙醇喷洒全身进行皮肤表面消毒，断头后沿矢状缝将颅骨切成两部分，去除脑组织以充分暴露颅底。体视显微镜下取出整个耳蜗，并移入盛有预冷的Hanks液的无菌培养皿中。打开蜗壳，依次剥离螺旋韧带、前庭膜及血管纹等结构。由于新生小鼠耳蜗尚未骨化，韧性较好，可用游丝镊夹住基底膜底回末端，将基底膜沿蜗轴完整分离。

　　1.4 耳蜗Corti器培养

　　预先在培养皿中滴入10 μL配制好的胶原凝胶液(由Ⅰ型鼠尾胶、10×BME和2% 碳酸钠溶液按9∶1∶1的比例混匀配制而成)，每个培养皿6个胶滴。室温下放置15～20 min，待胶原凝胶液凝固后加入1 mL无血清培养基(DMEM / F12培养基中加入1% BSA和10 U/mL的青霉素G并充分混匀)。将分离后的基底膜分为顶回、中回和底回三段，分别移入培养皿中。沿着胶滴边缘慢慢将基底膜移到顶端，使其正面朝上且平铺到凝胶表面，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h后再加入1 mL培养基，使培养基完全覆盖凝胶，然后放回培养箱中继续培养。在培养24、48 h和72 h后分别终止培养。

　　1.5 TRITC-鬼笔环肽荧光染色

　　终止时吸出培养基，向培养皿中加入含有4%多聚甲醛的0.1 mo1/L PBS溶液，4　℃下固定过夜。用游丝镊取下带有基底膜的凝胶，0.01 mo1/L PBS 漂洗3 次后，浸入0.25% Triton X-100 溶液中，室温下处理20 min。然后移入到TRITC- 鬼笔环肽(1∶200稀释)溶液中，室温下避光染色30 min。0.01 mo1/L PBS漂洗后将带有基底膜的凝胶移至滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，铺平放正并盖上盖玻片。荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞形态变化。

　　2 结 果

　　荧光显微镜下，可见TRITC标记的鬼笔环肽染色呈现红色荧光，主要定位在毛细胞的纤毛束。培养前，小鼠耳蜗毛细胞形态结构保持正常，外毛细胞的纤毛呈典型的“V”字形排列，而内毛细胞的纤毛则排列成“一”字形(图1A)。经体外培养24、48 h和72 h后，小鼠耳蜗毛细胞仍能保持良好的形态，三排外毛细胞和一排内毛细胞轮廓清晰可辨，纤毛束均排列整齐，未见倒伏(图1B～D)。

　　3 讨 论

　　哺乳动物的耳蜗毛细胞属于一种高度分化和稳定的感觉细胞，通常不再具备分裂增殖的能力，因此，耳蜗Corti器体外培养相对于其它器官培养而言具有更高的要求和难度。迄今为止，耳蜗Corti器体外培养仍是一种原代培养方法，而不能像其它组织细胞那样在体外条件下做到传代培养。然而，通过不断改进哺乳动物耳蜗Corti 器的体外培养方法以及改善培养基的成分，人们已经可以延长耳蜗Corti器的体外培养时间并能保持耳蜗正常的形态结构和组织学特性[1]。

　　国内外已有报道的耳蜗Corti器体外培养的方法大致分为两种，即无血清培养法和有血清培养法。Ding和Chen等[2，3]采用的是无血清培养法。他们将生后2～3 d的小鼠耳蜗基底膜分离出来，放入预先滴有胶原凝胶液的培养皿中，然后加入改良的无血清培养基(BME培养基中加入1%BSA、无血清补充剂、谷氨酰胺、葡萄糖、青霉素G 等物质)，再放入37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养24 h 或48 h。而Gross和刘英鹏等[4，5]采用的则是有血清培养法。他们分离出生后1～5 d的大鼠耳蜗基底膜，放入含有10%胎牛血清的DMEM或DMEM/F12培养基中，然后在37 ℃、5% CO2培养箱中连续培养24 h 或7 d。上述两种方法虽然都取得了满意的实验结果，即耳蜗毛细胞生长良好，结构完整，但仍然存在一些缺点。Ding等采用的无血清培养法，需要在培养基中添加昂贵的补充剂，因此成本较高且配制过程复杂;而Gross等在培养基中加入血清，易导致样本中非听毛细胞生长，从而不利于后期观察。为此，本实验在上述培养方法的基础上加以改进，我们选用了营养成分丰富的DMEM/F12培养基，仅向其中加入了1%BSA和10 U/mL青霉素G。结果显示，在体外培养24～72 h期间，小鼠耳蜗内、外毛细胞的纤毛束均排列整齐，毛细胞形态完好，结构清晰完整。这种培养基不仅配制成分简单，不易污染，而且也有利于毛细胞的后期观察,从而有效避免了上述培养方法的不足。

　　我们在操作过程中体会到，将基底膜平铺在胶原凝胶表面，通过利用来自于培养基的薄层表面张力可有效防止基底膜沉入到胶原组织中;将培养基分两次加入有利于基底膜和凝胶的紧密结合，使基底膜能牢固粘附于凝胶表面。这样有助于保持基底膜的伸展性，使耳蜗毛细胞暴露在表面，便于药物渗透、培养基的更换以及后期染色观察。

　　综上，本文建立了一种新生昆明小鼠耳蜗Corti器体外培养的简便方法，该方法具有操作简单易行、结果稳定、成本相对低廉、便于推广使用等诸多优点，可用于耳蜗的发育分化、药物耳毒性及其防护措施以及毛细胞再生等方面的体外实验研究。

　　【参考文献】

　　[1] Rastel D，Abdouh A，Dahl D，et al. An original organotypic culture method to study the organ of Corti of the newborn rat in vitro [J]. J Neurosci Methods，1993，47(1-2):123-131.

　　[2] Ding D，Stracher A，Salvi RJ. Leupeptin protects cochlear and vestibular hair cells from gentamycin ototoxicity [J]. Hear Res，2002，164:115-126.

　　[3] Chen FQ，Schacht J，Sha SH. Aminoglycoside-induced histone deacetylation and hair cell death in the mouse cochlea[J]. Neurochem，2009，108(5):1226-1236.

　　[4] Gross J，Machulik A，Amarjargal N，et al. Expression of prestin mRNA in the organotypic culture of rat cochlea [J]. Hear Res，2005，204(1-2):183-190.

　　[5] 刘英鹏，鄢开胜，王建亭，等. 新生大鼠耳蜗Corti器体外培养及其转基因表达[J]. 听力学及言语疾病杂志，2006，14(2):127-129.