苯乙酸对胶质瘤C6细胞中c-myc和Caspase-3表达的影响

　　作者：黄少伟，杨朝华，李齐广，吴全理，罗大山，王光绿 作者单位：广西北海市人民医院神经外科，广西北海536000

　　【摘要】 目的 观察诱导分化剂苯乙酸(phenylacetate，PA)对c-myc和Caspase-3表达的影响，探讨PA诱导胶质瘤C6细胞凋亡的机制。方法 体外培养胶质瘤C6细胞，实验组给予PA浓度5.0mmol /L诱导72h，对照组不用PA，分别用免疫细胞化学检测c-myc和Caspase-3的表达，图像分析比较表达水平的差异。结果 免疫细胞化学检测，两对照组和实验组中c-myc的表达分别为0.214±0.013和0.153±0.007，Caspase-3的表达分别为0.149±0.004和0.206±0.033。结论 PA能够下调c-myc的表达和增强Caspase-3的表达，其诱导胶质瘤C6细胞凋亡的机制可能与此有关。

　　【关键词】 苯乙酸酯类;神经胶质瘤;细胞凋亡

　　Phenylacetate affects the expressions of c-myc and Caspase-3 in rat c6 glioma cells

　　HUANG Shao-wei, YANG Chao-hua, LI Qi-guang, WU Quan-li,LUO Da-shan, WANG Guang-lu

　　(Department of Neurosurgery, People's Hospital of Beihai City, Beihai, Guangxi 536000, China; Department of Neurosurgery, West China Hospital of Shichuan University, Chengdu, Shichuan 610041, China)

　　Abstract: Objective To study the effects of differentiation inducer phenylacetate (PA) on the expression of c-myc and Caspase-3 in rat C6 glioma cells and explore the mechanism of PA action. Methods C6 glioma cells were cultured in vitro. In experiment group, C6 cells were induced by PA at concentration of 5.0mmol/L for 72 hours. In control group, no PA was administrated. The expression of c-myc and Caspase-3 was detected by using an immunocytochemistry technique. The differernces of the imaging presentation in the two groups were analyzed. Results The expressions of c-myc in control group and experiment group were 0.214±0.013 and 0.153±0.007, respectively, while the expression of Caspase-3 were 0.149±0.004 and 0.206±0.033, respectively. Conclusion PA can down-regulate the expression of c-myc and enhance the expression of Caspase-3, which might consequently induce apoptosis in C6 glioma cells.

　　Key words: phenylacetates; glioma; apoptosis

　　诱导分化剂苯乙酸(phenylacetate，PA)是一种苯丙氨酸的脱氨基产物，正常情况下以低浓度存在于人脑脊液和血液，能降低血浆中谷氨酰氨水平，对人体无毒副作用，1994年Samid[1]发现PA对胶质瘤有诱导分化和抑制生长作用。此外研究发现PA对子宫颈癌[2]、乳腺癌[3]和肾癌[4]等多种肿瘤也有抑制作用，PA具有很好的临床应用前景。在国外PA已进入Ⅱ期临床试验，但作用机理尚未完全清楚。前期的研究发现PA能诱导胶质瘤C6细胞凋亡[5]，笔者主要研究PA对c-myc和Caspase-3表达的影响，探讨PA诱导凋亡的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 大鼠胶质瘤C6细胞(引自中国科学院上海细胞生物学研究所);RPMI 1640培养基(Gibco,美国); 苯乙酸(sigma,美国);SABC免疫组化检测试剂盒(武汉博士德公司);c-myc和Caspase-3一抗(兔抗大鼠，武汉博士德公司);CO2培养箱(SANYO,日本);倒置光学显微镜IMT-2-12型(OLYMPUS，日本);OLYMPUS采集图像系统;LaserPix图像分析系统(Bio-Rad,UK)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 C6细胞以5×105/ml在100ml培养瓶中单层培养，置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱中培养，RPMI 1640培养基加入10%热灭活胎牛血清，碳酸氢钠2g/L，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml，取对数生长期的细胞进行实验。

　　1.2.2 免疫细胞化学检测c-myc和Caspase-3的表达 将经多聚赖氨酸处理的盖玻片放入6孔板中，C6细胞以5×105/ml接种培养，24h后更换为含有PA的培养基，浓度5.0mmol/L，培养72h后取出盖玻片，PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛缓冲液固定30min，PBS洗涤3次。按试剂盒说明进行检测操作(一抗工作浓度c-myc 1∶25，Caspase-3 1∶100)。结果判断: c-myc和Caspase-3阳性表达均位于胞浆内，呈棕黄色。用OLYMPUS采集图像系统采集图像，LaserPix图像分析系统进行图像分析，在统一放大倍数(400倍)下测定平均光密度(mean density，MD)，进行分析。

　　1.3 统计学处理 每个实验重复5次，计量资料结果数据表示为±s，作t检验，分析用软件SAS8.02完成。

　　2 结果

　　2.1 免疫细胞化学检测c-myc的表达 在C6细胞中有c-myc的表达(见图1)，图像分析显示MD为0.214±0.013。PA5.0mmol/L作用72h亦有c-myc的表达(见图4)，胞浆黄染减弱，图像分析显示MD为0.153±0.007，两者差异有高度显著性(t=8.93，P<0.01)。

　　2.2 免疫细胞化学检测Caspase-3表达 在C6细胞中有Caspase-3的表达(见图3)，图像分析显示MD为0.149±0.004。PA5.0mmol/L作用72h亦有Caspase-3的表达(见图4)，胞浆黄染明显增强，图像分析显示MD为0.206±0.033，两者差异有高度显著性(t=3.79,P<0.01)。

　　图1 c-myc 在C6细胞中的表达 SABC×400(略)

　　图2 PA5.0作用72h c-myc的表达 SABC×400(略)

　　图3 Caspase-3 在C6细胞中的表达 SABC×400(略)

　　图4 PA5.0作用72hCaspase-3的表达 SABC×400(略)

　　3 讨论

　　细胞凋亡是一种基因控制的细胞自主性的死亡过程，是维持内环境稳定的重要机制之一。目前认为肿瘤的发生与肿瘤细胞过度增殖有关，同时与凋亡不足也有关。细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，传递至半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)并使其活化开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局，从而使细胞凋亡得以完成，凋亡是一系列的基因表达调控的结果。

　　c-myc是与病毒癌基因同源的细胞癌基因，产物为c-myc蛋白。c-myc蛋白具有转录调节因子所具有的所有结构，包括蛋白的二聚体化结构区，转录活性区和DNA结合区域，具有调控细胞内其他基因表达的作用。本研究通过免疫细胞化学检测发现，PA能够通过下调c-myc的表达，诱导胶质瘤细胞凋亡。与此类似，有研究发现[6]，在结肠癌细胞中，mesalazine能够下调c-myc表达，促使细胞凋亡和抑制生长。一般认为c-myc蛋白可促进细胞的增殖，其后又发现c-myc可诱导细胞的凋亡，c-myc是诱导细胞的凋亡还是促进细胞增殖取决于细胞接受的其他信号[7]。还有研究表明[8]，c-myc诱导的细胞凋亡与cyt-c的释放有关，这一过程依赖于其他凋亡信号途径的信号传导如Fas/FasL凋亡传导通路。因此我们认为PA诱导凋亡可能与其下调c-myc表达有关。

　　另外本研究发现PA能显著增强Caspase-3的表达。caspase家族的14个成员中，最引人注目的是caspase-3。大量的事实证明，凋亡发生是个复杂的、由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。多种多样的刺激因素启动的信号激活caspase-3，引起多效基因变化，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活。可以说caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。caspase-3处于蛋白酶级联反应的下游，是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一[9]。本研究通过免疫细胞化学检测发现，PA能够通过下调c-myc的表达和增强Caspase-3的表达，其诱导胶质瘤C6细胞凋亡的机制可能与此有关，但详细的机制有待深入研究。

　　【参考文献】

　　[1] Samid D, Ram Z, Hudgins WR, et al. Selective activity of phenylacetate against malignant gliomas: Resemblance to fetal brain damage in phenylketonuria [J]. Cancer Res,1994,54(4):891-895.

　　[2] Ferrandina G, Filippini P, Ferlini C, et al. Growth inhibitory effects and radiosensitization induced by fatty aromatic acids on human cervical cancer cells [J]. Oncol Res,2000,12(9-10):429-440.

　　[3] Vasse M, Thibout D, Paysant J, et al. Decrease of breast cancer cell invasiveness by sodium phenylacetate (NaPa) is associated with an increased expression of adhesive molecules [J]. Br J Cancer,2001,84(6):802-807.

　　[4] Franco OE, Onishi T, Umeda Y, et al. Phenylacetate inhibits growth and modulates cell cycle gene expression in renal cancer cell lines [J]. Anticancer Res,2003,23(2B):1637-1642.

　　[5] 杨朝华，蔡博文，游潮.苯乙酸对胶质瘤C6细胞凋亡和细胞内游离Ca2+浓度的影响[J]. 中华神经外科杂志，2007, 23(1):63-65.

　　[6] Chu EC, Chai J, Ahluwalia A, et al. Mesalazine downregulates c-Myc in human colon cancer cells. A key to its chemopreventive action? [J]. Aliment Pharmacol Ther,2007,25(12):1443-1449.

　　[7] Alarcon RM, Rupnow BA, Graeber TG, et al. Modulation of c-Myc activity and apoptosis in vivo [J]. Cancer Res,1996,56(19):4315-4319.

　　[8] Juin P, Hueber AO, Littlewood T, et al. c-Myc-induced sensitization to apoptosis is mediated through cytochrome c release [J]. Genes Dev,1999, 13(11):1367-1381.

　　[9] Porter AG, Janicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis [J]. Cell Death Differ,1999,6(2):99-104.