冻化疗对G422胶质瘤细胞凋亡及调控机制的影响

　　作者：秦军, 王 辉, 涂汉军, 李新建， 王伦长 作者单位：郧阳医学院附属太和医院神经外科，湖北 十堰442000

　　【摘要】 目的:观察冷冻联合5-Fu对G422胶质瘤化疗敏感性的影响，并探讨其内在的分子机制。方法:建立G422胶质瘤动物模型，随机分组，分别施以化疗、冷冻、冻化疗;TUNEL法用于观察各组在不同时间点细胞凋亡的变化;免疫组化方法检测冷冻后p27kip1蛋白的表达。结果:冷冻与化疗均能引起肿瘤细胞凋亡，冻化疗的联合应用使凋亡率明显增加。冷冻中心区少有p27kip1的阳性表达，冻后周边区表达大为增加。冻后凋亡细胞与p27kip1的表达呈显著正相关(P<0.01) 。结论:冷冻能够提高G422胶质瘤对5-Fu的化疗敏感性，其发生机制可能与冻后p27kip1诱发肿瘤细胞凋亡有关;冻化疗的联合应用较单纯冷冻或化疗治疗恶性胶质瘤效果更为明显。

　　【关键词】 胶质瘤

　　The effect of cryotherapy on appoptosis and its mechanism in G422 glioma model QIN Jun,WANG Hui，TU Han-Jun,et al.(Department of Neurosurgery,Taihe Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000)

　　Abstract:Objective To observe the chemosensitivity of glioma treated by cryotherapy to 5-Fu and to explore the potential mechanism. Methods Experimental mice models with G422 glioma was established.Chemotherapy,cryotherapy and cryochemotherapy were performed respectively;TUNEL was used to detect glioma cell apoptosis of each group at different time points;The expression of the p27kip1 gene of the glioma treated by cryotherapy was analyzed by immunohistochemical staining.Results Cryotherapy and 5-Fu could induce apoptosis of G422 glioma,while the combination of cryotherapy and 5-Fu had a remarkably higher ratio of apoptosis.No expression of p27kip1gene was observed in the center of frozen area,the p27kip1 protein increased obviously in the periphery of the frozen area.The expression of p27kip1 was positively correlated with that of the numbers of apoptosis in glioma treated with cryotherapy(P<0.01).Conclusions Cryotherapy could enhance the chemosensitivity of G422 glioma to 5-Fu presumably through modulating the p27kip1 expression pattern;cryochemotherapy showed more potent effect on glioma apoptosis than that of cryotherapy or chemotherapy alone.

　　Key words：Cryochemotherapy;Glioma;Chemosensitivity;p27kip1

　　胶质瘤发病率高，术后易复发，手术切除结合放、化疗效果仍不满意，冻化疗的联合应用作为一种肿瘤治疗模式虽已有报道[1]，但其深入研究的报道较少。本研究利用G422胶质瘤载体模型初步探讨冷冻对其化疗敏感性的影响及其内在的分子机制。

　　1材料与方法

　　1.1瘤株的来源及动物模型的建立G422胶质瘤株由北京市神经外科研究所提供。健康昆明小鼠(购自中国医学科学院动物所,动物合格证号：01-3001)200只，周龄8周，体重18~22 g，雌雄不限。取生长11 d的皮下瘤源，用生理盐水将其研磨成瘤细胞悬液(1∶3)，细胞浓度在6.5×106个/ml，取0.1 ml细胞悬液分别接种于小鼠后下肢肌腹内。

　　1.2实验设计

　　1.2.1实验分组：待肿瘤生长至第9天，直径约2 cm，随机将动物分组：①对照组50只;②实验组150只，其中单纯化疗组、单纯冷冻组和冻化疗组各50只。冷冻、化疗、冻化疗实施后各组于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h每时间点各10只。

　　1.2.2冷冻实施：单纯冷冻组用3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后切开瘤旁皮肤，暴露肿瘤，用直径约5 mm探头(LCS-3000型冷冻治癌机，美国产)插入肿瘤中心，冻后90 s后自然复温(探头温度为-180 ℃);单纯化疗组：经腹腔注射5-氟尿嘧啶(5-Fu，18 mg/kg，上海旭东海普药业有限公司产);冻化疗组：冷冻实施与单纯冷冻组同，冻后5 min即经腹腔注射5-Fu(18 mg/kg);对照组未经任何处理。每组于各时间点处死动物切取瘤块按不同检测要求保存标本。

　　1.3细胞凋亡的原位检测4%多聚甲醛灌注固定标本，石蜡包埋，4 μm厚的切片作TUNEL染色，检测细胞凋亡，按原位细胞凋亡检测试剂盒(boehring Mannheim, Germany)说明进行。凋亡细胞核为棕黄颗粒染色，用装有目镜网格测微尺的光镜(400×)计算凋亡细胞数(个/0.0625 mm2)。

　　1.4免疫组化染色4 μm厚的石蜡切片，58 ℃烤片45 min，脱蜡入水，微波抗原修复，滴加一抗浓度为p27kip1多抗(Santa Cruz公司)1∶100， 4 ℃孵育过夜，SP药盒染色(SP-9001，北京中山)。p27kip1阳性表达为胞核呈棕黄色或棕褐色颗粒沉着，400倍光镜下每张切片计数单位视野阳性细胞数占细胞总数百分比，至少计算1 000个细胞，阳性细胞所占比率为p27kip1蛋白表达的百分数。

　　1.5统计学处理实验数据以x±s表示，采用SPSS 10.0数据统计软件进行单因素方差分析。对冷冻后p27kip1蛋白表达及凋亡细胞采用Pearson相关性分析。

　　2结果

　　2.1TUNEL染色结果凋亡细胞出现胞核和胞质结构上具有特征性的改变;冷冻后肿瘤的冻心区以大片非特异性浅黄色坏死为主，冷冻周边区凋亡细胞增多，单纯化疗后凋亡细胞散在或灶状分布;冻化疗联合组除具有单纯冷冻后凋亡细胞分布特点外，远离冻心的周边区凋亡也大为增多，其各时点TUNEL阳性细胞数显著多于其它各组;对照组仅有少量凋亡细胞散在分布。各组不同时间点细胞凋亡的变化见表1。 表1 各组不同时间点细胞凋亡的变化

　　2.2p27kip1蛋白表达p27kip1蛋白表达位于胞核呈棕黄色染色，对照组p27kip1阳性细胞比较均匀分布于肿瘤组织中，单纯化疗组与对照组比有显著性差异;实施局部冷冻后，冷冻中心几乎没有阳性表达，冻周区于冻后24、48、72 h表达明显增多，冻化疗后周边区各时间点p27kip1蛋白表达增加更为明显。冷冻和5-Fu对p27kip1蛋白表达的影响见表2。表2 冷冻和5-FU对p27kip1蛋白表达的影响(

　　2.3 p27kip1蛋白表达与凋亡细胞数相关性分析经Pearson相关性分析表明，冷冻后p27kip1蛋白表达与凋亡细胞数呈正相关(P<0.01)。3讨论研究表明冷冻使胶质瘤细胞产生凝固性坏死的同时，也可诱导其发生凋亡[2]，以往的观点认为，冷冻能够提高肿瘤细胞内5-Fu药物浓度，其原因与冻后血管内皮细胞紧密连接暂时开放、血管通透性增加有关[3]。本试验发现化疗药5-Fu可诱导胶质瘤细胞凋亡，冷冻诱导胶质瘤细胞凋亡的作用比5-Fu更明显，冻化疗的联合应用显著提高了肿瘤细胞的凋亡率。

　　p27kip1是一种细胞周期调节蛋白，于1994年Polyka等[3]在研究细胞抑制的机理时发现，在经转化生长因子-β和接触性抑制处理的细胞中存在一种分子量为27 kD的细胞周期抑制蛋白，它能与cyclin-CDK2和cyclin-CDK4复合物紧密结合，即为p27蛋白。p27kip1蛋白具有限制性调节细胞周期进程的作用，其水平随着细胞周期进程的改变而改变，p27kip1能广泛抑制各种周期素和CDK的活性使细胞周期停滞在G1期。p27kip1除了通过影响细胞周期的进程来干扰细胞的增殖外，其水平的高低还与细胞凋亡的发生有密切关系。Fujisda等[4]发现：p27kip1的过度表达在许多肿瘤中，都可以引起细胞凋亡的发生，并在HL-60细胞中，p27参与了神经酰胺诱导的细胞凋亡[4]。本研究发现：与对照组相比，单纯化疗组p27kip1蛋白表达增加，单纯冷冻后6、12、24、48、72 h 27kip1蛋白表达均明显增多，冻化疗后周边区各时间点p27kip1蛋白表达增加更为明显。另外，本组相关性研究表明，肿瘤凋亡细胞数与p27kip1蛋白在冻后表达的变化呈正相关(P<0.01)，而p27kip1对细胞凋亡的调控主要依赖蛋白水平，说明p27kip1蛋白的过度表达参与了化疗和冷冻诱导的细胞凋亡。本实验同时发现p27kip1蛋白表达变化趋势与凋亡同步，我们推测冷冻通过诱导p27kip1蛋白的高表达触发细胞凋亡，最终使冷冻联合5-Fu通过凋亡途径杀伤肿瘤细胞的能力显著增加。冷冻后的p27kip1蛋白表达变化是二者联合产生协同杀瘤效应的内在分子基础。

　　本试验观察到冷冻与5-Fu联合应用能显著提高G422胶质瘤细胞凋亡率，并尝试对其发生机制在分子水平进行探讨，为冻化疗联合应用于临床治疗恶性脑胶质瘤提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] Jerrel W, Benson H.Combined chemotherapy and cryosurgery for oral cancer[J].Am J Surg,1975,130(3):596-600.

　　[2] 秦 军，涂汉军，张亚卓,等.G422胶质瘤冷冻后细胞凋亡及相关基因表达的研究[J].中华神经外科杂志，2003，19(1)：30-33.

　　[3] Poliky K,Kato JK,Solomon MJ,et al.p27kip1,acyclin-CDK,inhibition,links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest[J].Genes D ev,1994,8(1):9-22.

　　[4] Fujisda S,Inuzuka m,Tanaka N,et al.Expression of p27 is associated with Bax expression and spontaneous apoptosis in oral and oaopharyngeal carcinoma[J].Carcer Int J,1999,84(3): 315-320.

　　[5] Yang HY,Ghil KC,Lee JH,et al.Involvement of p27 in ceramin-mediated apoptosis in HL-60 cells[J].Cacer Lett,2000,151(1): 39-48.