缺氧复氧性损伤对培养海马细胞ICAM-1表达影响及银信达莫的保护作用

　　作者：顾建军，高广忠，鲁峻，张勤，蒋霖，刘小星，王小林，殷荣建，尹春 作者单位：(南通大学附属泰州市人民医院神经外科，江苏泰州225300)

　　【摘要】 目的 研究缺氧复氧性损伤对培养海马细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达影响及银信达莫的保护作用，探讨其可能的机制。方法 将SD大鼠分设正常条件培养组、单纯缺氧复氧组(HR)、缺氧复氧+银信达莫组，于缺氧1h后复氧6h，测定海马细胞ICAM-1表达水平及细胞胞浆游离钙([Ca2+]i)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)水平。结果 海马细胞缺氧复氧刺激时，ICAM-1蛋白质表达、[Ca2+]i和MDA均有显著增加，而SOD、GSH、NOS明显下降;银信达莫可明显改善缺氧复氧性海马细胞ICAM-1的表达和MDA、[Ca2+]i超载增高的程度以及SOD、GSH、NOS下降程度。结论 海马细胞缺氧复氧通过直接或间接激活ICAM-1引起细胞损伤，但钙超载、氧自由基和NOS系统也共同参与了缺氧复氧性损伤。银信达莫通过直接或间接抑制上述各系统而达到减轻缺氧复氧性损伤。

　　【关键词】 缺氧，脑;海马细胞;细胞间黏附分子1;银信达莫

　　The effects of hypoxia reoxygenation induced injury on the expression of ICAM-1 in hippocampal neuron cells in culture and the protective function of YinXinDaMo

　　GU Jian-jun, GAO Guang-zhong, LU Jun, ZHANG Qin, JIANG Lin, LIU Xiao-xing, WANG Xiao-lin, YIN Rong-jian, YIN Chun

　　(Department of Neurosurgery, Taizhou People's Hospital Affiliated to Nantong University, Taizhou, Jiangsu 225300, China)

　　Abstract: Objective To investigate injury induced by hypoxia reoxygenation impacts on the expression of ICAM-1 in hippocampal neuron cells in culture and the protective function of YinXinDaMo. Methods The SD rats were allocated to a normal culture group, hypoxia reoxygenation alone group (HR group), a hypoxia reoxygenation+YinXinDaMo group, 6-hour reoxygenation following 1-hour hypoxia. The measurements of ICAM-1 levels, cytoplasmic free calcium ([Ca2+]i), nitric oxide synthase (NOS), superoxide dismutase (SOD), malonyl dialdehyde (MDA) and reduced glutatione form (GSH) were recorded. Results When stimulated by hypoxia reoxygenation, the elevated levels of ICAM-1, [Ca2+]i and MDA were obtained in hippocampal neuron cells, and SOD, GSH, NOS decreased significantly. YinXinDaMo could obviously improve the expression of ICAM-1 in hippocampal neuron cells with hypoxia reoxygenation, and also could inhibit the MDA, [Ca2+]i overload and the decrease of SOD, GSH, NOS. Conclusion Hypoxia reoxygenation directly or indirectly activated ICAM-1 to induce hippocampal neuron cells injury, but Ca overload, oxygen free radicals and NOS system are also involved in hypoxia/reoxygenation injury. YinXinDaMo directly or indirectly inhibits the mentioned above system to relieve the hypoxia reoxygenation injury.

　　Key words: hypoxia, brain; hippocampal neuron cells; ICAM-1; YinXinDaMo

　　目前认为缺氧复氧性损伤及钙反常性损伤是一个问题不同侧面的反映，虽然已有许多在体实验研究再灌注损伤的发生机制，但其确切的机制仍不清楚，研究还发现缺血再灌注损伤的原因是多因素所致的复合性损伤。但是，致损途径中的几个环节还仍不清楚。近来，细胞间黏附分子1(ICAM-1)的关系及其介导的中性粒细胞与内皮细胞粘附，引起中性粒细胞海马细胞的浸润增加，以及一氧化氮、一氧化氮合酶(NOS)、[Ca2+]i对氧自由基与再灌注损伤的关系引起了人们的关注。为此，我们利用海马细胞缺氧复氧性损伤模型，研究缺氧复氧时ICAM-1、NOS、细胞胞浆游离钙([Ca2+]i)、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)等的变化规律以及银信达莫对其表达的影响，探讨银信达莫对海马细胞缺氧复氧性损伤的保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠，体重(250±10)g;24h内SD新生鼠，均由南通大学实验动物中心提供。

　　1.1.2 主要试剂

　　DMEM干粉型培养基，新生牛血清;1∶250胰蛋白酶(Difco产品，美国);银杏内酯B(中国药品生物制品检定所);MDA、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)、[Ca2+]i、NOS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

　　1.1.3 主要仪器

　　倒置显微镜(重庆光电公司)，酶标仪(美国BIORAD公司)，二氧化碳孵育箱(法国JOUAN公司)，冷冻高速离心机(Hittech)，超净工作台(上海净化设备厂)等。

　　1.2 方法

　　1.2.1 海马神经细胞的培养

　　取新生1天的SD大鼠，75%乙醇消毒，无菌条件下取脑，分离双侧海马，剔除血管，用冰浴D-Hanks液洗2次，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶2ml，37℃、5% CO2培养箱中消化30min，每5min振荡1次。用等体积含10%胎牛血清的DMEM终止消化，吹打成细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM吹打成细胞悬液，分别经60目和200目的筛网过滤，并将滤液细胞数调整至5×105/ml，以100μl接种于涂有0.1mg/ml poly-L-lysine 96孔培养板中，使各孔细胞数基本相同，37℃、5% CO2培养箱中培养，24h后全量换液，48h后加入终浓度为10μmol/L阿糖胞苷作用24h更换新培养液，以后每2天半量换液，培养6天的海马神经细胞，用于实验。

　　1.2.2 培养细胞缺氧复氧模型制作、干预方法

　　收集培养至第5天的贴壁海马细胞制作细胞悬液，将细胞悬液浓度调整至105/ml，置于充有95%N2与5%CO2混合气体(37℃)的孵箱中缺氧1h，然后再置入95%O2和5%CO2孵箱中复氧6h;取细胞标本备测。银信达莫干预组于缺氧前1h加入药物EGB(50μg/ml)，其余处理同缺氧复氧组。

　　1.2.3 检测方法

　　培养海马细胞用半定量ELISA法测定其ICAM-1的含量，ICAM-1单克隆抗体浓度为1∶3000(对照管不加抗体)，TMB显色，DG3022型酶联免疫吸附检测仪在449nm处测定光吸收值。海马细胞NOS检测用精氨酸比色法测定。海马细胞GSH含量测定参照二硫代硝基苯甲酸比色法测定。海马细胞游离钙测定用Fura2荧光分光光度法，海马细胞MDA用硫代巴比妥酸比色法测定，海马细胞SOD活性测定用黄嘌呤过氧化物酶法。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据以(±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析，上述统计分析用Stata 7.0统计软件完成。

　　2 结果

　　2.1 培养海马细胞ICAM-1表达变化及干预的影响

　　正常条件培养组ICAM-1表达量较少，缺氧复氧组的ICAM-1表达量均较正常组明显升高(P<0.01);而银信达莫干预组ICAM-1表达均较正常组有所增加，但P>0.05，较缺氧复氧组有明显减低，P<0.05，见表1。

　　2.2 海马细胞NOS、[Ca2+]i、SOD、MDA和GSH变化及药物的保护作用

　　在缺氧复氧组中[Ca2+]i、MDA均较正常组明显升高(P<0.01)，NOS、SOD和GSH均较正常组明显降低(P<0.01)，见表1。说明银信达莫干预可减轻[Ca2+]i、MDA升高的幅度并减轻NOS、SOD和GSH下降的幅度。表1 海马细胞缺氧复氧刺激时各项指标的变化及银信达莫干预的影响(略)

　　3 讨论

　　海马是大脑中对缺氧较为敏感的脑区，有较高的易损性，常用于脑缺血缺氧[1]及兴奋性毒性损伤的机制研究。本实验在以往用体外培养的大鼠皮层神经细胞研究的基础上，进一步用无血清培养的大鼠胎鼠海马神经元进行缺氧复氧损伤研究，无血清培养的海马神经元纯度高，且神经元生长状态好。建立缺氧复氧损伤模型以模拟临床脑I/R损伤的病理生理过程。

　　缺血缺氧时，自由基主要通过兴奋性氨基酸代谢途径、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统和NOS途径产生。脑缺血缺氧使脑细胞线粒体破坏，不能通过有氧代谢产生ATP，黄嘌呤和O2在黄嘌呤氧化酶的作用下产生O2-，缺血再灌注时，烷自由基使脂质过氧化物自由基反应得以延续，进一步攻击不饱和脂肪酸;同时，Ca2+可提高黄嘌呤氧化酶的活性，Fe3+可促进O2-迅速转为OH·，重新激发自由基级联反应[2]。银杏叶中黄酮类成分有较强抗氧化和清除自由基作用，银杏苦内酯 B等萜类成分也能降低自由基的形成[3]，大鼠短暂性脑缺血模型应用银杏苦内酯B和银杏苦内酯A可明显减轻海马CA1区锥体细胞的迟发性损伤，对脑缺血缺氧损伤具有保护作用，但机制尚不完全清楚。本实验结果显示，海马细胞缺氧复氧时较正常培养组Ca2+和氧自由基代谢产物MDA明显增加，而其内源性清除剂SOD、GSH、NO合成的限速酶NOS均有下降;提示上述因素共同参与了海马细胞缺氧。而银杏内酯B的干预后，银杏内酯B能显著降低Ca2+，MDA含量，以及使细胞内SOD、GSH、NO合成的限速酶NOS均显著升高，说明银杏内酯B可以抑制脂质过氧化损伤，提高内源性抗氧化酶的活力，提示银杏内酯B对海马细胞的保护作用与其具有抗氧化性有关。

　　ICAM-1又称CD54，属于细胞黏附分子家族中的一类，通过与其配体结合介导白细胞与血管内皮细胞的黏附引起组织损伤[4]。因此ICAM-1在缺氧缺血性脑损伤中的作用日益受到重视。Zhang等[5]应用Northen印染法和免疫组织化学法分别监测了大鼠脑缺血再灌注区ICAM-1mRNA的表达和ICAM-1蛋白质的生成 ，发现二者在不同时段均明显增高。此外，Soriano等[6]发现ICAM-1有重要的介导脑缺血再灌注损伤作用。缺氧缺血性脑损伤时，局部血管内皮细胞以及白细胞被病变组织大量产生的炎性介质(如TNF、IL-1等)所激活，ICAM-1数量及功能明显上调，造成白细胞和内皮细胞大量牢固地黏附，这些白细胞再通过直接的机械梗阻和对神经元的细胞毒性损伤加重。本研究发现正常海马细胞也有少量ICAM-1表达，缺氧复氧时海马细胞ICAM-1表达量均较正常组明显升高(P<0.01);但是银信达莫干预后ICAM-1明显下降，较缺氧复氧组有明显减低(P<0.05)。有研究表明活性氧参与脂多糖活化NF-κB，银杏内酯B抑制NF-κB的激活与其具有的清除氧自由基、抗氧化的作用有关。而NF-κB活化后能调控一系列基因的表达：如黏附分子家族的ICAM-1、VCAM-1，前炎症性细胞因子TNF-α、IL-1β，化学趋化因子MCP-1以及一些受体分子IL-2受体，T细胞受体α、β链等[7]。这些物质都能直接或间接地导致微循环障碍，内皮及组织损伤。故银信达莫对海马细胞缺氧复氧性损伤的保护机制可能会是通过银信达莫的抗氧化的作用，抑制NF-κB对其下游基因ICAM-1的表达。

　　【参考文献】

　　[1]Danielisova V, Nemethova M, Burda J. The protective effect of amino guanidine on cerebral ischemic damage in the rat brain [J]. Physiol Res,2004,53(5):533-540.

　　[2]Grech ED, Dodd NJ, Jackson MJ, et al. Evidence for free radical generation after primary percutaneous transluminal coronary angioplasty recanalization in acute myocardial infarction [J]. Am J Cardiol,1996,77(2):122-127.

　　[3]李玲,吴春云,郭泽云,等.银杏叶提取物对沙土鼠短暂性脑缺血后脑电图和海马迟发性神经元死亡的影响[J].云南中医中药杂志,1999,26(3):143.

　　[4]Lndsberg PJ, Carpen U, Paetau A, et al. Endothelial ICAM-1 expres sion associated with inflammatory cell response in ischemic stroke [J]. Circulation,1996,94(5):939-945.

　　[5]Zhang RI, Chopp M, Zologa C, et al. The temporal profile of ICAM-1 protein and Mrna expression after transient MCA occlusion in the rat [J]. Brain Res,1995,682(1-2):182.

　　[6]Soriano SG, Lipton SA, Wang YF, et al. Intercellular adhesion molecule -1-deficent mice are less susceptible to cerebral ischemiar reperfusion injury [J]. Ann Neurol,1996,39(5):618.

　　[7]顾大勇,曾祥元,马布仁.NF-κB与微循环障碍[J].中国微循环,2001,5(1):77-79.