大鼠三叉神经痛模型的建立

　　作者：张亮 游洋 作者单位：东南大学附属中大医院 神经外科,江苏 南京 210009

　　【摘要】 目的：建立类似人类原发性三叉神经痛的大鼠模型。方法：雄性SD大鼠在YZ20T6同光路手术显微镜直视下用铬肠线结扎眶下神经达到局部压迫的效果，术后两周行行为学观察并测量各组疼痛反应阈值，术后10周行病理形态学检查。结果：结扎眶下神经约两周后，大鼠对疼痛刺激反应的敏感性增加，疼痛反应阈值模型组与对照组比较有显著性差异(P<0.01);其病理表现类似人类三叉神经痛的神经病变脱髓鞘改变。结论：对大鼠三叉神经根慢性压迫性损伤可造成三叉神经痛样大鼠模型，其病理表现为三叉神经根的脱髓鞘改变，三叉神经半月节细胞未见明显异常改变。

　　【关键词】 三叉神经痛 动物模型 脱髓鞘改变 大鼠

　　原发性三叉神经痛是老年人群中常见病、多发病。随着人口老龄化倾向，该病的发病率有增高趋势。目前治疗三叉神经痛的手术方法很多，但多为破坏性治疗，且疗效不能令人满意。因此有必要建立一个可靠的大鼠三叉神经痛模型，以便进一步了解和研究三叉神经痛的发病过程及治疗方法。尽管目前三叉神经痛的发病机理学说众多，但比较公认且有纤维解剖学证据的是微血管压迫学说[12]，本实验模型正是以此学说为基础建立的。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　选择健康成年雄性SpragueDauley (SD)大白鼠18只，体重200 220 g。18只大鼠随机分为模型组、手术对照组和正常对照组3组，每组6只，模型组行眶内结扎大鼠眶下神经，手术对照组只暴露不结扎。

　　1.2 模型建立

　　2%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔内注射(40 mg·kg-1)麻醉。大鼠取俯卧位，8%硫化钠溶液脱毛,3%的碘伏消毒，铺无菌巾。手术是在YZ20T6同光路手术显微镜直视下完成的。作头顶部中线直切口，显露额骨和鼻骨,暴露眼眶，可见眼眶的边界由上额骨、额骨、泪骨和颧骨组成，对眼眶周围仔细解剖游离。将眶内容物用一个棉签轻轻拨开即可见到位于眶底部内侧的眶下神经，约1.5 mm粗细。在眶内从近端仔细分离眶下神经至远端的眶下孔，用两根铬肠线(50)间距约2 mm力度适中地结扎在眶下神经上，为达到理想的效果，压迫程度的标准为：在显微镜下可见结扎线使神经的直径略微变细，但尚不阻断神经外膜的血液循环。切口用丝线(50)缝合。在对照组中，眶下神经以同样方法被暴露，但不被结扎[3]。

　　1.3 行为测试

　　将各组大鼠分别于手术前1 d,术后7、14、28 、42、56 和70 d行机械刺激反应阈值测试。机械刺激反应阈值是由STOELTING.WOOD DALE,IL公司提供的VonFreyFilament(感觉测试器)来测定，刺激部位为眶下神经在面部感觉支配区域——围绕鼻区中央的触须部位及周围有毛皮肤。手持刺激棒缓慢接近大鼠，先在手术的对侧刺激3下，使细丝弯曲，再在手术侧刺激3下，每一强度的细丝共刺激6次。在此过程中，细丝的强度由低到高依次递增。动物的阳性反应包括：(1)经刺激即表现为快速的后退动作，大鼠为避免面部进一步被接触，倦缩身子向笼壁靠拢，或将头面部藏在身下，躲避刺激物。(2)攻击行为。大鼠亦可表现出快速抓咬刺激物，做出攻击动作。(3)非对称性的面部搔抓，表现为至少连续3次搔抓面部刺激区域的动作，通常合并后退动作。出现以上3种反应中任意1项或1项以上即认为是刺激实验阳性，使大鼠产生阳性反应细丝强度最小值即为疼痛反应阈值。观察各组大鼠手术前后对于不同强度细丝刺激产生痛觉反应阈值的变化，与对照组比较，进行统计学分析。

　　1.4 病理形态学观察

　　1.4.1 电子显微镜观察 将各组大鼠于手术后10周处死，取眶下神经组织、三叉神经半月节组织标本约1 mm3以4%戊二醛固定，常规电镜制片，在H600型透射电镜下观察并摄片，主要观察对象为神经髓鞘、雪旺细胞、神经节细胞内线粒体、粗面内质网及核糖体的超微结构变化。

　　1.4.2 HE染色 将各组大鼠于手术后10周处死，取眶下神经组织、三叉神经半月节标本以10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、常规HE染色，光镜下观察并摄片。观察神经纤维束、三叉神经半月节细胞、雪旺细胞的病理变化。

　　1.4.3 髓鞘染色 将各组大鼠于手术后10周处死，取眶下神经纤维组织以10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，以WEIL液染色，光镜下观察神经髓鞘的变化并摄片。

　　1.4.4 甲苯胺蓝染色 将各组大鼠于手术后10周处死，取三叉神经半月节组织以10%甲醛固定、石蜡包埋、切片，以甲苯胺蓝染液(苯胺油、甲苯胺蓝、无水酒精组成)经过直入下染色、流水冲洗、二甲苯脱水及换洗等步骤完成。染色后的节细胞被染成蓝色，观察节细胞内NISSL体、细胞核在数量、质量及形态上的改变。

　　2 结 果

　　2.1 模型动物的行为学改变

　　术后12 14 d，实验大鼠眶下神经面部感觉支配区(即触须部皮肤及其周边长毛的部位)对于机械刺激的痛觉敏感性明显增加，能够引起大鼠逃避反应或攻击性行为(称之为三叉神经痛样反应),反应阈值从手术前≥12.5 g减小到≤1.4 g，同时实验大鼠对侧眶下神经的皮肤分布区对疼痛刺激的敏感性亦明显增加。这种双侧高反应性在手术后10周仍然存在，而在正常和对照组大鼠中，对于疼痛刺激的反应性只有轻微改变。统计结果表明：手术结扎组大鼠术后14 d双侧面部对疼痛刺激的反应阈值较手术前有显著性差异(ANOVA：P<0.01)，结扎组大鼠的反应阈值与手术对照组及正常对照组进行组间比较有显著性差异[RMANOVA：F(1，14)=16.376，P<0.01]。见表1。表1 手术前后不同时间大鼠疼痛反应阈值变化

　　2.2 模型大鼠神经系统的病理学改变

　　HE染色光镜下神经纤维及神经节细胞形态上均比较正常，神经纤维光滑，无断裂;神经节细胞膜完整，胞核大小、形态正常，核仁清楚。WEIL髓鞘染色下可见有明显的脱髓鞘现象，表现为髓鞘迂曲、肿胀、断裂消失，见图1a。三叉神经半月节的甲苯胺蓝染色可见神经节细胞内大量蓝染的NISSL小体，细胞核形态正常，未见明显的异常病理学改变，见图1b。

　　a.模型大鼠神经束(髓鞘染色 10×20)可见部分神经纤维外周髓鞘脱失，呈空泡状(↑所示);b.模型大鼠

　　半月节细胞(甲苯胺蓝染色10×40)可见细胞内尼氏小体浓染，与正常节细胞未见明显差异(↑所示)

　　图1 模型大鼠神经系统病理学检查结果2.3 模型大鼠神经系统超微结构改变

　　正常有髓纤维的轴突形态规则，髓鞘厚度基本一致，髓鞘的板层结构清晰、致密;雪旺细胞核结构清楚、胞浆均匀，完整包裹有髓和无髓纤维。正常节细胞内有大量密集排列的粗面内质网，其间充满核糖体;线粒体异常丰富是节细胞的另一特点。模型大鼠神经系统超微结构主要表现为：髓鞘结构紊乱，轴突变细，处于偏心位置，髓鞘增厚、板层松解，髓鞘局灶性断裂、破坏，呈虫蚀状的局灶性脱髓鞘改变，见图2。三叉神经半月节细胞与正常相比未见明显异常改变。

　　3 讨 论

　　目前，国内外建立三叉神经痛的动物模型有3种：第1种为脑闩下蛛网膜下腔注射微量青霉素GK引起大鼠三叉神经痛样反应模型[4];第2种为猫去牙髓模型[5];第3种为慢性压迫性损伤大鼠眶下神经模型(CCIION)[3]。由于第3种模型的致痛机理与血管压迫学说较为接近，故选择CCIION模型动物进行实验。

　　与有关文献[3，56]报道结果一致,手术两周后CCIION大鼠的结扎侧及结扎对侧均表现为对疼痛反常的高度敏感性。如表1所示结扎侧与结扎对侧组疼痛反应阈值与正常组及对照组有显著性差异，说明模型建立是成功的。目前，大多数国内外学者已认为三叉神经根的脱髓鞘改变是三叉神经痛的病理基础。髓鞘的完整性起到绝缘作用，脱髓鞘使轴突裸露，传入传出纤维间产生“短路”，这种“短路”冲动累计到一定总和即发生了阵发性剧痛[7]。CCIION大鼠出现三叉神经痛的行为学症状后，于手术后10周取神经根作病理切片，结果显示与人类该病的神经病理表现大体相同。前面提到过该模型的建立方法为慢性压迫损伤，从致痛机理上与普遍公认的血管压迫学说类似，这样，就从致痛机理和病理改变两方面模拟了人类疾病，从而为进一步了解和研究三叉神经痛的发病过程及治疗方法提供了依据。

　　对于结扎对侧亦出现三叉神经痛样反应的机理目前尚不完全明确，主要学说有：(1)引起疼痛反应是一种“交叉兴奋”的结果[8]。(2)Vos等[9]认为模型大鼠之所以产生痛样反应，是与三叉神经中枢核团内与疼痛有关的P物质及抗氟化物的酸性磷酸酶免疫活性增加有关。(3)Benoist等[10]在1997年和1999年通过背侧丘脑和主要躯体感觉皮脂的神经电生理测定，发现结扎对侧的刺激亦导致上述神经核团内有异常生物电改变，只是严重程度较结扎侧为轻，可能的解释为慢性压迫所导致的神经干病变亦引起高位神经中枢的病变。

　　【参考文献】

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　　[3]BART P,STRASSMAN A M,MACIEWICZ R J.Behavior evidence of trigeminal neuralgia neuropathic pain following chronic constriction injury to the rat’s infraorbital nerve[J].The Journal of Neuroscience,1994,14(5):27082723.

　　[4]钱忠明，孙小进，何志娟.脑闩下蛛网膜下腔注射微量青霉素GK引起大白鼠三叉神经痛样反应[J].中国病理生理杂志,1986,2(2):120121.

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　　[6]CHRISTENSEN D,GAUTRON M,GUILBAUD G,et al.Combined systemic administration of the glycine/NMDA receptor antagonist,(+)HA966 and morphine attenuates painrelated behaviour in a rat model of trigeminal neuropathic pain[J].Pain，1999,83:433440.

　　[7]王忠诚.神经外科学[M].武汉：湖北科学技术出版社，1999:851857.

　　[8]DEVOR M,WALL P D.Crossexcitation in dorsal root ganglia of nerve injured and intact rats[J].Neurophysiol，1990,64:17331746.

　　[9]VOS B P,MACIEWICZ R J.Alterations of peripheral nerve morphology and changes in fluoride resistant acid phosphatase and substance Pimmunoreactivity in the trigeminal nucleus caudalis in an experimental model of trigeminal neuropathic pain[J].Am Pain Soc Abstr,1990,9:5658.

　　[10]BENOIST J M,GAUTRON M,GUILDAND G.Experimental model of trigeminal pain in a rat by constriction of one infraorbital nerve(ION) :changes in neuronal activities in the Sml cortices corresponding to the ION[J].Exp Brain Res,1999,126:383389.