银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞氧化应激的影响

　　作者：王杰1，程言博2，印晓星1 作者单位：(1.徐州医学院药学院，江苏徐州221002;2.徐州医学院附属医院神经内科，江苏徐州 221002)

　　【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine， 6-OHDA)诱导的PC12 细胞氧化应激的保护作用及其机制。方法 经不同剂量GBE预处理体外培养的PC12细胞后，加入6-OHDA诱导多巴胺能神经元损伤模型。用MTT法检测PC12细胞活力;分光光度法测定细胞过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性和总抗氧化能力(T-AOC)的水平;硫代巴比妥法测定细胞丙二醛(MDA)含量。结果 100 μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24 h，细胞活力较正常对照组明显降低(P<0.01)，CAT、GSH-Px、T-SOD的活性和T-AOC的水平明显降低(P<0.05)，MDA含量明显升高(P<0.05);与模型组比较，不同剂量GBE预处理组的PC12细胞活力逐渐升高，CAT、GSH-Px、T-SOD的活性和T-AOC的水平明显升高(P<0.05)，MDA含量明显减少 (P<0.05)。结论 GBE对6-OHDA诱导的PC12 细胞氧化应激具有抑制作用，提高CAT、 GSH-Px、T-SOD的活性和T-AOC的水平可能是其抗氧化作用的机制之一。

　　【关键词】 银杏叶提取物;6-羟基多巴胺;PC12细胞;氧化应激

　　Effects of Ginkgo biloba extract on 6-OHDA-induced oxidative stress

　　in PC12 cells

　　WANG Jie1, CHENG Yanbo2, YIN Xiaoxing1*

　　(1. School of Pharmacy, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2. Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002)

　　Abstract: Objective To explore the protective effects and the causal mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) on the oxidative stress induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in PC12 cells. Methods Dopaminergic neuronal injury model was induced by addition of 6-OHDA into PC12 cells cultured in vitro and pretreated with different doses of GBE. Cell viability, the levels of four antioxidative indexes [including total superoxid dismutase (T-SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) and total antioxidant capacity (T-AOC)] and the content of malondialdehyde (MDA) were assayed by MTT, visible spectrotometry and the method of thiobarbituric acid reaction, respectively. Results The cell viability of PC12 cells treated with 100 μmol/L 6-OHDA for 24 h was lower, the levels of four antioxidative indexes were lower and the MDA content was higher as compared to the control group (P<0.05). Compared with the model group, GBE of different doses could markedly relieve the toxicity of 6-OHDA on PC12 cells (P<0.05), increase the cell viability and the levels of four antioxidative indexes (P<0.05) and decrease the content of MDA (P<0.05). Conclusion GBE may reduce the damage of oxidative stress induced by 6-OHDA on PC12 cells by increasing the levels of T-SOD, CAT, GSH-Px and T-AOC, which might be one of the causal mechanisms of the antioxidative effect of GBE.

　　Key words: Ginkgo biloba extract; 6-hydroxydopamine; PC12 cells; oxidative stress

　　帕金森病(Parkinson disease, PD)是老年人常见的进行性中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为黑质致密区的多巴胺(DA)能神经元缺失及胞质内包涵体Lewy小体形成，导致黑质纹状体通路破坏及尾状核、壳核中DA含量减少[1]。目前PD发病机制尚不十分清楚。当前的观点认为氧化应激是PD发病过程中DA能神经元选择性易损性的主要机制[2]。PD尸检标本研究发现患者黑质线粒体呼吸酶链复合物Ⅰ活性降低以及线粒体形态异常，线粒体功能障碍导致活性氧过量生成，氧自由基清除系统的缺陷在PD发病机制中具有重要的病因学意义，故采用抗氧化药物治疗PD已成为新疗法中的重要研究方向[3]。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)是具有多种药理活性的中药制剂，临床已广泛应用于心脑血管疾病及老年痴呆症的治疗，但用GBE治疗PD报道甚少。为探讨GBE是否通过减轻细胞氧化应激减少多巴胺能神经元凋亡，本研究以具有神经内分泌细胞和神经元特性的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(rat phaeochromocytoma, PC12 细胞)为对象，利用特异性DA能神经损毁剂6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)制作细胞氧化应激模型，检测GBE对相关抗氧化指标的影响，探讨GBE对氧化应激损伤神经元的保护作用及其机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验药物 GBE为德国威玛舒培博士药厂产品(17.5 mg/5 ml)，有效成分包括24%黄酮苷类和6%萜类。

　　1.2 试剂及细胞株 PC12细胞株购自中国科学院上海细胞库;6-OHDA购自Sigma公司，胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、4-甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司，DMEM 培养基为美国GIBCO公司产品，新生牛血清、马血清购自杭州四季青生物工程公司，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)水平以及丙二醛(MDA)含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Bicinchoninic acid(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天生物技术研究所。

　　1.3 细胞培养及药物处理 PC12细胞冻于液氮中，实验时进行复苏并培养于含体积分数为5%马血清、10%新生牛血清，105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素及2 mmol/L L-谷氨酰胺、pH值为7.0～7.2的DMEM培养液中(完全培养液)，于37℃、5% CO2条件下培养至细胞80%融合时消化、传代，选取对数生长期细胞进行实验。

　　实验分5组：①正常对照组(NC组),PC12细胞正常培养于DMEM完全培养液中;②模型组(6-OH组),完全培养液中加入终浓度为100 μmol/L的6-OHDA(预实验以6-OHDA 25、50、100、150、200 μmol/L 孵育PC12 细胞6、12、24 h和48 h后以MTT测定细胞存活率，结果选定6-OHDA 100 μmol/L作用24 h作为实验的干预点，其细胞生存率为51.6%);③GBE低、中、高剂量组(GL、GM、GH组)，GBE(终浓度分别为10、20、40 mg/L，通过预实验确定)作用2 h后，加入终浓度为100 μmol/L 6-OHDA的完全培养液。从6-OHDA加入起继续培养24 h，供检测。每组6孔，重复3次。

　　1.4 MTT法检测PC12细胞存活率 细胞以2×107个/L接种于96孔培养板，培养24 h后进行药物处理，按1.3要求分5组。每组设6孔，同时设3孔无细胞空白对照。加药后继续培养24 h，终止培养前4 h每孔加入MTT液20 μl，置37℃继续培养4 h。弃上清，每孔加入二甲基亚矾(DMSO)150 μl，振荡10 min，终止反应并充分溶解甲臜颗粒，用全自动酶标光度仪进行比色, 波长为570 nm，记录各组的D值(D测=D实-D空均)。各实验组PC12细胞活力以各实验组的D值与正常对照组的D值的比值表示。实验重复3次。

　　1.5 CAT、T-SOD、GSH-Px的活性、T-AOC水平及MDA含量测定 将80%左右融合、状态良好的细胞进行消化，制成细胞悬液(2×108/L)，各取2 ml加入6个培养瓶，正常培养至80%左右融合，换含1%新生牛血清的培养液细胞同步化12 h后，按1.3分组要求加药继续培养24 h。以预温至37℃的PBS 2 ml洗涤2次，吸干多余PBS。置冰袋上，各加入细胞裂解液300 μl，铺满细胞生长面，裂解20 min，收集细胞于1.5 ml EP管，4 000 r/min离心10 min，转移上清于一新EP管，得细胞处理液。按BCA蛋白测定试剂盒说明测定蛋白含量，严格按照各项检测试剂盒说明操作测定T-SOD、CAT和GSH-Px的活性、T-AOC的水平及MDA含量。

　　1.6 统计学处理 计量资料用±s表示，用SPSS 13.0统计软件进行分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验。P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 PC12细胞活力的变化 与NC组相比，6-OH组PC12细胞的活力下降(P<0.01)，提示6-OHDA对细胞有损伤作用。GBE低、中、高剂量给药后，相对于6-OH组，PC12细胞的活力逐渐提高(P<0.05)，提示GBE在一定范围内对PC12细胞损伤具有保护作用。见图1。

　　2.2 GBE对细胞氧化应激的影响 与NC组相比，6-OH组PC12细胞的T-AOC水平、T-SOD活性、CAT活性和GSH-Px活性均有明显降低(P<0.05)，而MDA含量明显升高(P<0.05)，提示6-OHDA使得PC12细胞处于较强的氧化应激状态。与6-OH组相比，GM、GH组细胞的T-SOD、GSH-Px、CAT的活性和T-AOC水平均随着GBE剂量的增加而逐渐升高(P<0.05)。GL组细胞仅T-SOD活性和T-AOC水平有明显升高(P<0.05)，但CAT和GSH-Px的活性与6-OH组相比差异无显著性(P>0.05)。而GL、GM、GH组细胞的MDA含量均随着GBE剂量的增加而逐渐降低(P<0.05)，并呈剂量依赖性。这些结果表明，GBE能明显改善6-OHDA造成的PC12细胞的氧化应激状态。见表1。表1 GBE对PC12细胞T-AOC水平，T-SOD、CAT 和GSH-Px活性及MDA含量的影响与NC组比较：cP<0.05;与6-OH组比较：fP<0.05

　　3 讨 论

　　近年来许多基础和临床研究表明，氧化应激反应增强在PD黑质神经元凋亡中起着主要作用，氧自由基清除系统的缺陷在PD发病机制中具有重要的病因学意义[4]，故采用抗氧化治疗正日益成为治疗PD的重要手段。氧化应激损伤涉及到氧化应激和抗氧化系统的失衡，因此，可以通过摄入抗氧化剂限制氧化损伤[5]。6-OHDA作为类似DA的嗜神经毒素，通过介导细胞内外的氧化反应产生活性氧和醌类物质，诱导单胺氧化酶产生过氧化氢及对线粒体呼吸链的直接抑制等引发氧化应激反应，特异性损害中枢DA能神经元，最终导致黑质-纹状体通路功能减退而产生PD症状[6]。研究显示，应用高效液相色谱法及电子自旋捕捉法检测发现PD患者脑黑质中谷胱甘肽水平显著降低，病变部位脂质过氧化水平明显增强[7]。在PD黑质纹状体投射系统受损发生氧化应激的过程中，自由基对生物膜的破坏起了重要作用，使生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生MDA，生物膜结构及通透性改变，生物膜的活性丧失，线粒体、溶酶体等细胞器发生裂解，细胞死亡[8]。在正常的生理状态下，人体代谢产生的自由基可以经自由基清除系统灭活。人体自由基清除的酶主要包括SOD、CAT、GSH-Px及抗氧化非酶小分子GSH[9]。

　　PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，它能表达酪氨酸羟化酶并且合成多巴胺，因而也被称为DA能细胞[10]。GBE主要含黄酮甙类、萜类和酚类等，具有清除自由基和过氧化脂质、对抗兴奋性神经递质的释放、拮抗血小板活化因子等多种药理活性[11]，临床已广泛用于心脑血管疾病及老年痴呆症的治疗。但GBE对氧化应激损伤神经元是否有保护作用，报道甚少。

　　本研究采用6-OHDA诱导PC12细胞为PD氧化应激细胞模型，并通过不同剂量GBE处理，采用MTT法检测细胞活性，硫代巴比妥法测定MDA含量，分光光度比色法测定T-SOD、CAT、GSH-Px的活性及T-AOC(包括还原性GSH、维生素C)水平。结果发现，6-OHDA诱导PC12细胞后MDA含量升高，T-SOD、CAT、GSH-Px的活性及T-AOC水平均降低，提示PC12细胞的氧化应激反应被激活，处于氧化应激状态，符合PD氧化应激的发病机制，与文献报道一致[4]。而不同剂量GBE处理后对以上抗氧化指标的降低具有抑制作用，同时降低了MDA含量，且具有一定的剂量依赖性。这些结果有力地证明GBE在离体实验中具有强大的抗氧化活性。因此，我们推测GBE可能通过提高T-SOD、CAT、GSH-Px的活性及T-AOC水平，降低MDA含量，减少氧化应激对神经细胞的损伤，从而发挥抗PD作用。

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