血管内皮生长因子在脑缺血耐受大鼠中的表达

　　作者：王国峰，沈娜娜，王静云，陈卫，赵仁亮 作者单位：青岛大学医学院附属医院神经内科，山东 青岛 266003

　　【摘要】 目的 检测局灶性脑缺血预处理诱导大鼠脑缺血耐受模型再灌注不同时间窗血管内皮生长因子(VEGF)的表达，探讨其在脑缺血耐受中的作用。方法 将55只Wistar大鼠随机分成假手术对照组(SS+SS，5只)、假手术+再缺血组(SS+MCAO，25只)、缺血预处理+再缺血组(IP+MCAO，25只)，后两组再随机分成5个亚组。线栓法阻塞大脑中动脉(MCAO)建立局灶性缺血预处理模型(缺血预处理10 min)，分别在缺血预处理后1、3、7、14、21 d进行再次缺血2 h再灌注22 h，然后取脑检查。应用苏木精伊红染色观察脑组织病理变化并测定脑梗死体积，观察神经行为缺损,免疫组化法检测VEGF蛋白表达。结果 IP+MCAO组1、3、7 d亚组与SS+MCAO组相应亚组比较，神经行为缺损评分明显降低,梗死体积明显减小,VEGF表达明显增高，差异均有显著性(t=2.357～11.479，P<0.05)。结论 缺血预处理诱导了脑缺血耐受，预缺血诱导的VEGF表达增加在脑缺血耐受中发挥重要作用。

　　【关键词】 血管内皮生长因子A;缺血预处理;脑缺血;大鼠

　　EXPRESSION OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR IN A RAT MODEL OF CEREBRAL ISCHEMIA TOLERANCE

　　WANG GUOFENG, SHEN NANA, WANG JINGYUN, et al

　　Department of Neurology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China) ;

　　[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) at different time points after reperfusion in a cerebral ischemiatolerant rat model induced by focal ischemia preconditioning, and study the significance of VEGF in cerebral ischemia tolerance. Methods Fiftyfive healthy Wistar rats were randomized to three groups: the sham operation group (SS+SS，n=5), the sham opertation and subsequent middle cerebral artery occlusion (MCAO) group (SS+MCAO,n=25), and the ischemia preconditioning and subsequent MCAO group (IP+MCAO,n=25). The latter two groups were further divided into five subgroups. For ischemia preconditioning, the rats were performed MCAO with filament ligation for 10 min. On the 1st, 3rd, 7th, 14th and 21st day after ischemia preconditioning, the rats were given the second MCAO for 2 h followed by 22 h reperfusion. Brain tissues were biopsied and tissue sections stained with hematoxylin and eosin (HE) for histological study and determination of infarction volume. The models were evaluated with neurological deficit score. The expression of VEGF was determined by immunohistochemical staining. Results Compared with the corresponding subgroups of SS+MCAO group, the neurologic scores were significantly reduced, the volume of cerebral infarction was significantly decreased and the expression of VEGF significantly increased in the 1st, 3rdand 7stday subgroups of IP+MCAO group (t=2.357-11.479，P<0.05). ConclusionIschemia preconditioning induced cerebral ischemia tolerance. IPinduced upregulation of VEGF expression plays an important role in the induction of ischemia tolerance.

　　[KEY WORDS] vascular endothelial growth factor A; ischemic preconditioning; brain ischemic; rats

　　已有研究结果表明，短暂性脑缺血即缺血预处理(IP)可诱导机体内源性保护作用，抵御其后发生的较严重的甚至致死性脑缺血事件，减轻缺血组织的病变程度，诱发脑的缺血耐受(IT)[1]，这为机体内源性抗缺血或低氧损害的神经保护机制提供了新的思路。但迄今对脑缺血耐受的发生机制及诱发神经保护的最佳时间窗尚无定论。近年研究显示，血管内皮生长因子(VEGF)在缺血性脑损伤过程中扮演重要角色，脑缺血后，VEGF不仅通过促进血管内皮细胞增殖和迁移参与血管生成，并增强血管通透性;其在神经保护和神经发生等方面也发挥了重要作用[2]。但目前关于VEGF在脑缺血耐受机制中作用的研究较少。本研究通过建立局灶性预缺血诱导的大鼠脑缺血耐受模型，动态检测缺血预处理后再灌注不同时间窗VEGF表达，并探讨其在脑缺血耐受中的作用。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及分组

　　成年健康雄性Wistar大鼠55只，体质量250～300 g，清洁级，由青岛市药物检验所实验动物中心提供。随机分为以下3组：①缺血预处理+再缺血组(IP+MCAO，25只)，预缺血10 min后按不同的再灌注时间分为5个亚组，分别于再灌注1、3、7、14、21 d后给予2 h大脑中动脉阻塞(MCAO)，再灌注22 h后处死;②假手术+再缺血组(SS+MCAO，25只)，分5个亚组，假手术代替预缺血(即仅暴露颈总动脉及分叉处，不插线阻断MCA)，在假手术后按前述不同时间点给予2 h的MCAO，再灌注22 h后处死;③假手术对照组(SS+SS，5只)，两次均为假手术，即两次均仅给予暴露颈总动脉及分叉处，于第2次假手术24 h后处死。

　　1.2 预缺血及再缺血模型制备

　　采用由ZEALONGA等[3]改进的MCA二次线栓法。首先经左侧颈外颈内动脉插线(18.5±2.0)mm，阻断MCA，10 min后将线栓退出至颈外动脉(ECA)并埋于皮下，完成缺血预处理。在规定时间点用相同方法再次MCAO，缺血2 h后将线栓抽出至ECA，形成第二次再灌注，22 h后处死。动物清醒后观察其行为和神经症状，以动物清醒后出现右前肢不能伸展、爬行时向右侧转圈并存活至规定时间点作为造模成功的标准。各组动物术中均用白炽灯照射使其肛温维持在(37.0±0.5)℃左右，术后单笼饲养。

　　1.3 检测指标及方法

　　1.3.1 神经行为功能评分

　　按MENZIES等[4]等级评分法对其神经功能进行评分：无明显功能缺损为0分;提尾时对侧前肢屈曲为1分;拉尾时对侧前肢的抓力减弱为2分;可向各方向自发运动而仅当拉尾时向对侧转圈为3分;自发向对侧转圈为4分。

　　1.3.2 梗死体积检测

　　采用苏木精伊红(HE)染色。各组大鼠在规定时间内，用40 g/L多聚甲醛行心内灌注后断头取脑。将大脑沿冠状位横切为6片(厚2 mm)，去除额极，将切好的脑片固定于同一固定液中4 h。常规脱水，透明，浸蜡和石蜡包埋。每个蜡块切取1张切片(厚5 μm)，行HE染色观察病理变化;另5张切片使用Simple PCI图像分析软件(美国Compix公司)计算梗死体积。梗死体积百分比=(非缺血侧体积-缺血侧正常脑组织体积)/非缺血侧体积×100%，非缺血侧体积或者缺血侧正常脑组织体积=(s1+s2+s3+s4+s5)×2。其中s1～s5表示5张切片应该计算的面积，2表示每片厚度(mm)。

　　1.3.3 VEGF蛋白检测

　　采用SABC免疫组织化学染色法。严格按试剂盒说明进行操作。DAB显色，光镜下观察，胞浆出现棕色颗粒为阳性着色。高倍镜(400倍)下在皮质区和纹状体区随机取4个视野计数阳性细胞。即用型SABC试剂盒、兔抗大鼠VEGF多克隆抗体试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS 13.0及PPMS 1.5[5]统计学软件进行数据处理，结果用±s表示。各组同一时间点之间比较采用t检验，组内不同时间点之间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组不同时间神经行为功能评分比较

　　对照组大鼠无神经功能损伤症状，神经功能评分为0分。其余两组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍， SS+MCAO组、IP+MCAO组各亚组间评分比较，差异无显著意义(F=0.081、2.056，P>0.05)。IP+MCAO组1、3、7 d亚组大鼠神经缺损评分明显低于SS+MCAO组相应亚组，差异有显著性(t=2.357～3.207,P<0.05)。见表1。表1 各组大鼠不同时间神经行为功能评分结果及比较(略)

　　2.2 各组不同时间脑组织病理变化及梗死体积的比较

　　对照组大鼠HE染色神经细胞的数量及形态分布正常，无梗死灶。SS+MCAO组与IP+MCAO组左侧大脑中动脉供血区，包括大脑皮质、纹状体、海马区等表现出不同程度的损伤改变：梗死灶中心可见明显组织稀疏，神经细胞出现脱失及细胞变形;梗死灶周围神经元、神经胶质细胞肿胀，部分细胞核固缩、浓染，出现胶质细胞浸润。其中，SS+MCAO组各亚组间梗死体积比较，差异无显著意义(F=0.387,P>0.05);IP+MCAO组以3 d亚组梗死体积减小最为明显(F=25.745,q=4.373～9.859,P<0.05)，并且1、3、7 d亚组梗死体积较SS+MCAO组相应亚组明显减小，分别减小22.3%、36.1%、25.9%，差异有显著意义(t=5.880～10.801,P<0.01)。见表2。 表2 各组大鼠脑组织梗死体积的百分比及其比较(略)

　　2.3 各组不同时间VEGF表达的比较

　　对照组大鼠未见有明显VEGF阳性表达。SS+MCAO组与IP+MCAO组可见较多的VEGF蛋白阳性表达细胞，主要分布于缺血灶及周围的神经胶质细胞、神经元及微血管内皮细胞，胞浆棕黄色，着色明显。其中，VEGF在IP后1 d即明显升高，持续至7 d(F=28.878、33.815，q=5.709～13.567，P<0.05),明显高于SS+MCAO组的相应亚组(t=2.718～11.479,P<0.05)，高峰出现在IP后3 d。见表3。表3 各组大鼠缺血灶及周边区VEGF阳性细胞计数比较(略)

　　3 讨 论

　　本文的研究结果显示，脑缺血再灌注损伤后，大鼠出现不同程度的神经功能障碍，缺血损伤区神经细胞数量减少，部分细胞呈核固缩、破碎等现象;而通过IP后，梗死灶中心区明显减小，缺血侧脑组织水肿程度减轻，周围区结构完整的神经细胞明显增多;IP+MCAO组的1、3、7 d亚组动物神经行为功能评分明显低于同时间点SS+MCAO组的相应亚组，其梗死体积较同时间点SS+MCAO组的相应各亚组分别降低22.3%、36.1%、25.9%，说明通过10 min的IP可降低脑梗死体积，促进缺血后神经功能的恢复，有效降低其后脑缺血事件的严重性，诱发脑缺血耐受的发生，其缺血耐受产生的高峰期出现在预处理后3 d，持续1～7 d。

　　VEGF是一种特异性血管内皮细胞(ECs)有丝分裂原，是目前发现的最强烈的增加血管通透性物质之一，选择性地直接作用于内皮细胞膜上酪氨酸受体VEGFR1和VEGFR2，诱发ECs增殖、迁移以及细胞间的相互作用和管腔的形成，在缺血性脑损伤中发挥着重要作用。VEGF的表达受许多因素的调控，缺血或低氧是诱导VEGF表达的最主要的因素[6]。研究发现，在缺血性脑损伤半暗带低氧区，低氧激活低氧诱导因子1α(HIF1α)的表达，激活的HIF1α 诱导VEGF 及其受体水平表达增加;VEGF 与其受体结合后，一方面促使微血管内皮细胞增殖、迁移，促使新血管生成，改善局部血供，并保护内皮细胞不发生程序性死亡，从而减轻缺血性脑损伤;另一方面通过直接或间接抑制神经细胞凋亡而保护神经元[78]。本研究结果显示，SS+MCAO组与IP+MCAO组均可见较多的VEGF阳性表达细胞，分布于缺血灶及周围的神经胶质细胞、神经元及微血管内皮细胞，表明VEGF可能在缺血性脑损伤早期的恢复过程中具有重要的作用。因此，如何在缺血性脑损伤早期诱导VEGF 及其受体大量表达为缺血性脑损伤病人的治疗提供了线索。

　　ZHANG等[9]研究发现，在永久性局灶性脑缺血大鼠的缺血半暗带，新血管的形成始于缺血后6～24 h，并一直延续28 d，而VEGF的表达在2～14 d内持续增高，提示VEGF表达的时空分布和血管形成呈正相关。另有研究结果表明，在脑缺血急性期，VEGF对神经细胞、雪旺细胞及星形胶质细胞等还具有直接的神经营养和神经保护作用，并能直接刺激神经发生和迁移[2]，促进缺血后神经功能恢复。但值得注意的是，缺血早期应用VEGF可增加血脑脊液屏障渗漏及出血性转化的风险。本文研究结果显示，IP+MCAO组1、3、7 d亚组VEGF阳性表达明显高于SS+MCAO组的同时间点各亚组，而相应14、21 d亚组之间比较差异无显著性。该结果证实短暂性脑缺血预处理诱导了缺血及周边区VEGF的表达增加，其表达变化与脑缺血耐受的时间基本一致，提示VEGF在脑缺血耐受中发挥了重要作用，10 min的预缺血诱导脑缺血耐受产生过程中，VEGF可能通过促进血管新生、神经发生及神经保护等多种分子机制发挥其生物学作用。

　　综上所述，短暂性缺血预处理可诱导脑缺血耐受的产生，VEGF在预处理后产生脑缺血耐受的相应时间窗内表达有所增加。VEGF的表达上调可能在脑缺血耐受中发挥了重要作用。

　　【参考文献】

　　[1]BLANCO M, LIZASOAIN I, SOBRINO T, et al. Ischemic preconditioning:a novel target for neuroprotective therapy[J]. Cerebrovasc Dis, 2006,21(Suppl 2):3847.

　　[2]HANSEN T M, MOSS A J, BRINDLE N P. Vascular endothelial growth factor and angiopoietins in neurovascular regeneration and protection following stroke[J]. Curr Neurovasc Res, 2008,5(4):236245.

　　[3]LONGA E Z, WEINSTEIN P R, CARLSON S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20:8491.

　　[4]MENZIES S A, HOFF J T, BETZ A L. Middle cerebral artery occiusion in rats：a neurological and pathological evaluation of a reproducible model[J]. Neurosurgery, 1992,31:100107.

　　[5]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志， 2009,24(1):2932.

　　[6]LAUDENBACH V, FONTAINE R H, MEDJA F, et al. Neonatal hypoxic preconditioning involves vascular endothelial growth factor[J]. Neurobiol Dis, 2007,26:243252.

　　[7]MU D, JIANG X, SHELDON R A, et al. Regulation of hypoxiainducible factor 1alpha and induction of vascular endothelial growth factor in a rat neonatal stroke model[J]. Neurobiol Dis, 2003,14:524534.

　　[8]孙忠玲,董瑞剑,赵仁亮,等. 低氧诱导因子1α在大鼠脑缺血耐受中的表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(5):443445.

　　[9]ZHANG Z G, ZHANG L, TSANG W, et al. Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption of bloodbrain barrier and angiogenesis after focal cerebral ischemia[J]. Cereb Blood Flow Metab, 2002,22:379392.