单侧黑质纹状体通路损毁诱发大鼠伏核神经元放电频率增加

　　作者：张巧俊，蔺雪梅，刘健，杨慧丽，吴仲恒，刘欣 作者单位：西安交通大学医学院：1. 第二附属医院神经内科，陕西西安 710004;2. 生理学与病理生理学系，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 观察单侧黑质纹状体通路损毁对大鼠伏核(nucleus accumbens, NAc)神经元电活动的影响。方法 采用在体细胞外记录方法研究正常大鼠和帕金森病(Parkinsons disease, PD)大鼠NAc神经元放电频率和放电形式的变化。结果 对照组和PD组大鼠NAc神经元的平均放电频率分别是(5.0±0.5)Hz(n=25)和(8.6±0.7)Hz(n=26)，PD组大鼠NAc神经元的放电频率显著高于对照组(P<0.01)。在对照组，88%(22/25)的神经元呈不规则放电，12%(3/25)呈现爆发式放电;而在PD组，具有不规则和爆发式放电的神经元比例分别为92%(24/26)和8%(2/26)，两组大鼠NAc神经元的放电形式无明显差异(P>0.05)。结论 单侧黑质纹状体通路损毁诱发大鼠NAc神经元的放电频率增加。

　　【关键词】 伏核;帕金森病;电生理学;大鼠

　　Unilateral lesion of the nigrostriatal pathway induces an increase offiring rate of nucleus accumbens neurons in the rat

　　Zhang Qiaojun, Lin Xuemei, Liu Jian, Yang Huili, Wu Zhongheng, Liu Xin

　　1. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710004;

　　2. Department of Physiology and Pathophysiology,

　　Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To investigate the changes in neuronal activity of the nucleus accumbens (NAc) of rats following unilateral lesion of the nigroatriatal pathway. Methods The changes in the firing rate and firing pattern of NAc neurons were examined with extracellular recording methods in control and Parkinsons disease (PD) rats. Results The results showed that the mean firing rate of NAc neurons in control and Parkinsons disease (PD) rats was (5.0±0.5)Hz (n=25) and (8.6±0.7)Hz (n=26), respectively. The mean firing rate of NAc neurons in PD rats was significantly increased when compared to that of control rats (P<0.01). In control rats, 88% (22/25) of NAc neurons fired irregularly and 12% (3/25) fired in bursts. In PD rats, 92% (24/26) of the neurons fired irregularly and 8% (2/26) in bursts. The firing patterns of the neurons between the control and PD rats did not reach a significant level (P>0.05). Conclusion Unilateral lesion of the nigroatriatal pathway induces an increase of the firing rate of NAc neurons.

　　KEY WORDS: nucleus accumbens; Parkinsons disease; electrophysiology; rat

　　帕金森病(Parkinsons disease, PD)多发生于中老年人群，是一种以中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺能神经元进行性退变为主要病理特征的神经系统变性疾病。临床表现以进行性加重的运动迟缓、肌强直、静止性震颤和姿势步态异常为特征。但是PD不仅仅是一个运动系统的疾病，研究发现在部分PD患者有抑郁、焦虑和痴呆的表现，并且这些表现可出现在运动系统症状之前[1]。磁共振和尸检发现PD患者边缘系统的杏仁核和海马的体积缩小，这些结构中的神经元减少和路易氏体形成。上述研究表明，黑质纹状体通路的变性导致了边缘系统形态和功能的改变[2]。伏核(nucleus accumbens, NAc)是边缘系统的重要组成部分，它发出纤维投射到脑内许多核团，同时也接受其他核团的纤维投射。研究证实NAc接受来自皮质、腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)、SNc、背缝核和蓝斑的传入投射，它在行为控制、药物成瘾、镇痛、学习与记忆等方面具有重要的作用[34]。然而，黑质纹状体通路的变性对NAc神经元活动的影响目前尚不清楚。因此，本研究以6羟基多巴胺(6hydroxydopamine, 6OHDA)PD模型大鼠为对象，采用玻璃微电极在体细胞外记录方法，观察PD模型大鼠在SNc多巴胺能神经元损毁后NAc神经元电活动的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 PD大鼠模型的建立

　　实验选用西安交通大学实验动物中心提供的健康雄性SD大鼠22只，体重230-350g。大鼠在标准环境饲养1周，随机分为对照组(n=10)和PD组(n=12)。PD组大鼠在水合氯醛(300mg/kg，腹腔注射)麻醉下固定于脑立体定位仪上，根据PaxinosWatson大鼠脑定位图谱确定右侧SNc的位置：AP -4.8-5.3mm;L 1.8-2.3mm;D 7.1-7.3mm[5]。注射6OHDA前30min，先给大鼠注射地西帕明(25mg/kg，腹腔注射;Sigma产品)以保护去甲肾上腺素能神经元。6OHDA(Sigma产品)溶于含0.1g/L抗坏血酸的生理盐水中，用前配制。10μL微量注射器与玻璃微电极相连，尖端直径约50μm，分两个位点在SNc注射6OHDA，每点4μg/2μL，总量8μg/4μL，给药速度1μL/min，注射完毕后留针5-10min，退针。6OHDA注射后1周，给大鼠注射阿朴吗啡(0.05mg/kg，皮下注射)，10min后诱发向健侧旋转每5min大于20转者，表明PD模型成功，列为实验对象[6]。

　　1.2 电生理记录

　　电生理记录在SNc损毁后第3周进行。大鼠在乌拉坦(1.2g/kg，腹腔注射)麻醉下固定于脑立体定位仪上，并确定右侧NAc的位置：AP 1.5-2.2mm;L 1.2-1.8mm;D 5.8-7.2mm[5]。采用玻璃微电极细胞外记录法记录NAc神经元的放电。电极尖端直径1-2μm，阻抗10-20MΩ，充灌液为0.5mol/L醋酸钠(含20g/L膀胺天蓝)。细胞放电经微电极放大器显示于记忆示波器上，以观察电位波形和细胞放电的形式，同时信号输入监听器监听。将信噪比大于3∶1的、稳定的单细胞放电经生物电信号采集与分析系统输入计算机后，做实时观察、储存和进行频率及放电形式的分析，每一神经元的采样时间5-10min。整个实验过程中监测大鼠心电，直肠温度维持在(37±0.5)℃。

　　根据放电间隔图(interspike interval histogram, ISIH)确定神经元的放电形式。每一神经元ISIH的生成最少包含500个动作电位，bin宽4ms。依据ISIH图将神经元的放电形式分类。规则放电：ISIH呈对称分布;不规则放电：ISIH呈随机分布;爆发式放电：ISIH呈现逐渐衰减的正偏态分布。本研究还从ISIH中测量和计算了众数(mode)、不对称指数(asymmetry index, AI)和变异系数(coefficient of variation, CV)，以协助判断神经元放电形式的变化。众数指最高频率的放电间隔(interspike interval, ISI);AI为众数与平均ISI的比值，反映ISIH的形状，该值小于1表示正偏态分布;CV是ISI的标准差与平均ISI的比值，反映神经元活动的规律性[6]。

　　1.3 组织学定位

　　电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳膀胺天蓝标记记录位点(-20μA，15min)。大鼠在麻醉下经心脏灌注生理盐水，随后用40g/L多聚甲醛灌注固定，迅速断头取脑，固定4h。冠状冰冻切片，片厚50μm，确定被记录神经元的位置。

　　1.4 统计分析

　　采用SPSS11.0软件对位于NAc内的神经元进行统计分析。实验数据以±s表示。两组大鼠NAc神经元放电频率的比较采用独立样本t检验，平均ISI、众数、AI和CV的比较采用MannWhitney U检验;两组大鼠放电形式的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　对照组大鼠NAc神经元放电频率的变化范围是1.8-8.9Hz[(5.0±0.5)Hz, n=25]，PD组大鼠NAc神经元放电频率的变化范围是2.7-14.9Hz(8.6±0.8, n=26)。与对照组相比，PD组大鼠NAc神经元的放电频率显著增高(P<0.01，图1A)。

　　对照组大鼠的NAc神经元表现出2种放电形式，不规则放电的神经元是88%(22/25)，爆发式放电的神经元占12%(3/25)(图2A-图2C)。在PD组大鼠，也有2种形式的神经元放电，其不规则放电和爆发式放电的神经元分别为92%(24/26)和8%(2/26，图2C)。经χ2检验，两组大鼠NAc神经元的放电形式无显著差异(P>0.05)。

　　对照组大鼠的平均ISI是(260±29)ms，PD组大鼠为(142±14)ms，PD组大鼠的平均ISI明显缩短(P<0.01，图1B)，说明PD组大鼠NAc神经元的放电频率增高，导致平均ISI缩短。NAc神经元放电形式的参数众数、AI和CV在两组大鼠之间无显著差异(图1C-图1E)，反映2组大鼠NAc神经元的放电形式没有明显变化。

　　经组织学确认，电生理记录的神经元均位于NAc内。

　　3 讨 论

　　本实验分别从10只对照组大鼠记录到25个神经元放电，从12只PD组大鼠记录到26个神经元的电活动，经组织学确认这些神经元均位于NAc内。NAc是腹侧纹状体的一部分，它的传入纤维来自：①前额叶皮质、眶皮质和前扣带皮质;②VTA、杏仁核和SNc;③中缝背核和蓝斑[34]。前额叶皮质和VTA是其主要的传入纤维。NAc的传出纤维主要投射至边缘系统各结构和基底神经节。NAc内95%的神经元是棘状投射神经元，并以抑制性GABA作为神经递质。NAc与大脑皮质、基底神经节和边缘系统之间的广泛而复杂的纤维联系决定了其功能的多样性。它在行为功能的调节、认知、情绪、镇痛和药物成瘾等方面发挥作用。NAc神经元的电活动取决于神经元本身及传入投射对其活动的影响。本实验通过对比正常大鼠和PD组大鼠NAc神经元的电活动发现，黑质纹状体通路损毁导致NAc神经元的放电频率明显增高，但放电形式无显著改变，提示除了NAc神经元自身活动发生变化外，更为重要的是其兴奋性和抑制性传入之间的平衡发生了显著改变，即兴奋性传入活动增强，而抑制性传入活动减弱，最终导致NAc神经元的放电频率增高。

　　PD的主要病理变化是SNc的多巴胺能神经元进行性变性、坏死，导致纹状体中多巴胺水平降低，进而引起基底神经节环路的功能发生改变。研究发现黑质纹状体通路的变性也引起脑内其他核团的功能活动发生变化。在1甲基4苯基1,2,3,6四氢基吡啶诱发的PD小鼠，杏仁核中酪氨酸羟化酶阳性纤维的密度降低约20%[7]，多巴胺能神经元的变性导致SNc多巴胺能纤维投射区的多巴胺和多巴胺的代谢产物显著降低[8]，以及多巴胺D1和D2受体表达的异常[9]。NAc主要的兴奋性谷氨酸能传入纤维来自额叶皮质和杏仁核，而它们又接受VTA和SNc的多巴胺能纤维支配[34]。在体细胞内记录研究证实局部给予多巴胺，以及电刺激VTA引起额叶皮质单个锥体神经元自发活动的降低，说明多巴胺抑制锥体神经元的活动。黑质纹状体通路的变性导致额叶皮质多巴胺含量的降低和多巴胺D1、D2受体的下调;电生理学研究发现在6OHDA损毁的大鼠，内侧前额叶皮质锥体神经元的放电频率增加[10]。PD时多巴胺能神经元的变性和缺失不仅局限于SNc，同时VTA的多巴胺能神经元也发生变性和坏死。免疫组化结果表明PD大鼠VTA的多巴胺能神经元减少高达45%-60%[11]。因此，VTA中的多巴胺能神经元的减少，将引起额叶皮质谷氨酸能锥体投射神经元传出活动的增加，进而导致NAc神经元电活动的增强。NAc的另外一个兴奋性传入来自杏仁核，然而在PD大鼠研究发现杏仁基底外侧核神经元的活动没有显著改变。

　　VTA和SNc的多巴胺能传出纤维抑制NAc神经元的活动。局部给予多巴胺和多巴胺受体激动剂抑制多数NAc神经元的电活动。在PD状态下由于VTA和SNc内多巴胺能神经元的变性导致了多巴胺能传出纤维对NAc神经元抑制作用的降低，使得NAc神经元去抑制而表现出电活动增强。形态学研究发现NAc接受中脑缝核的5羟色胺(5hydroxytryptamine, 5HT)能神经纤维支配，在NAc中有多种受体亚型的表达，包括高密度的5HT4、中等密度的5HT2A/2C和5HT1B以及低密度的5HT3和5HT1A受体。因此，5HT递质系统也参与NAc神经元活动的调节。有报道显示NAc内局部给予5HT和5HT受体激动剂增加了核团内多巴胺的水平，而释放出的多巴胺抑制NAc神经元的活动。神经病理学和神经生化学研究发现，在PD患者和猴的脑内缝核中的5HT能神经元显著减少，导致5HT能神经元的投射区和脑脊液中的5HT含量明显降低[12]。我们推测在SNc中的多巴胺能神经元变性后，NAc中5HT含量减少，进而引起多巴胺水平降低，最后导致NAc神经元活动增强。NAc也接受来自蓝斑的去甲肾上腺素能投射，损毁正常大鼠的蓝斑显著降低NAc中多巴胺的含量，说明正常状态下蓝斑的去甲肾上腺素能投射易化NAc中的多巴胺释放[13]。PD患者的尸检研究发现蓝斑中的去甲肾上腺素能神经元显著减少，以及脑脊液中的去甲肾上腺素含量明显降低。这种变化将引起NAc中多巴胺含量减少，而引起NAc神经元放电频率增高。

　　综上所述，由于中枢神经系统解剖和功能的复杂性，我们的在体实验结果证实黑质纹状体通路的损毁诱发了NAc神经元的放电频率显著增高。这种变化可能主要与额叶皮质兴奋性谷氨酸能锥体神经元传出活动的增强和NAc中多巴胺含量的降低导致该核团中的神经元去抑制有关。鉴于NAc参与体内多种功能的调节，黑质纹状体通路的变性引起NAc神经元活动的改变也为PD状态下行为功能的调节和认知、情感功能紊乱的研究提供了新线索。

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