糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注对NFκBp65表达的影响

　　作者：毛诗贤， 楚兰， 陈红群 作者单位：(贵阳医学院附院 神经科， 贵州 贵阳 550004)

　　【摘要】 目的： 探讨阻断泛素蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway，UPP)对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。方法： 将SpragueDawley大鼠随机分成正常对照组(A组)、假手术组(B组)、非糖尿病组(C组)、糖尿病组(D组)、糖尿病治疗组(E组)及糖尿病治疗对照组(F组)，链脲佐菌素腹腔注射制作糖尿病模型，线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型;用clastolactacystin βlactone阻断UPP，免疫组织化学方法观察再灌注24 h后NFκBp65的表达。结果： 脑缺血再灌注24 h后，NFκBp65表达在D组较C组增加，在E组较D组和F组减少(P<0.05)。结论： 糖尿病局灶性脑缺血NFκBp65表达增多，阻断UPP可通过抑制NFκBp65的活化而产生神经保护作用。

　　【关键词】 糖尿病; 脑梗塞; 再灌注损伤; 大鼠，spraguedawley

　　Expression of NFκBp65 after Focal Cerebral Ischemia Reperfusion in Diabetic Rats

　　MAO Shixian, CHU Lan, CHEN Hongqun

　　(Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To study the mechanism of blocking ubiquition proteasome pathway (UPP) in protection of brain from ischemia reperfusion caused injury in diabetic rats. Methods: SpragueDawley (SD) rats were randomly divided into control group (group A), sham operation group (group B), nondiabetes cerebral infarction group (group C), diabetes cerebral infarction group (group D), diabetes cerebral infarction treatment group (group E) and diabetes cerebral infarction treatment control group (group F). Diabetic model was made by injection of streptozotocin through abdomen. Transient focal cerebral ischemia reperfusion was produced by middle cerebral artery occlusion for 2 hours in SD rats. The UPP was blocked by clastolactacystin βlactone. The expression of NFκBp65 was detected by immunohistochemistry method in 24 h after reperfusion. Results: In 24 h after the reperfusion, expression of NFκBp65 in group D was higher than in group C, and was lower in group E than in groups D and F (P<0.05). Conclusion: Expression of NFκBp65 increases in diabetic cerebral ischemia reperfusion rats, and the blocking UPP may perform neuroprotection effect by inhibiting the activation of NFκBp65.

　　[Key words] diabetes mellitus; brain infarction; reperfusion injury; rats,spraguedawley

　　糖尿病是脑缺血的重要危险因素，目前认为炎症反应在糖尿病加重脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。炎症级联反应的中心靶点被认为是NFκB，NFκB的激活直接由泛素蛋白酶体途径(ubiquition proteasome pathway，UPP) [1]调节。有证据表明，通过干预 UPP 能够有效减轻脑缺血后的炎症反应和再灌注损伤[2],2007年3月～2008年9月，通过观察糖尿病大鼠脑缺血再灌注阻断UPP后NFκBp65表达的变化，探讨阻断UPP对糖尿病脑缺血再灌注损伤的神经保护机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂与药品

　　链脉佐菌素(streptozotocin，STZ，美国Sigma公司生产)，clastolactacystin βlactone (ALEsix公司，Switzerland)，SABC免疫组化试剂盒、DAB显色剂、I抗NFκBp65、PBS等购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 实验动物分组

　　健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠，体重(250±20)g，由贵阳医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为正常对照组(A组)、假手术组(B组)、非糖尿病组(C组)、糖尿病组(D组)、糖尿病治疗组(E组)及糖尿病治疗对照组(F组)。A组不做任何处理，B组大鼠只作插线不作栓塞，C组大鼠制作大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，D组、E组和F组大鼠均先制作糖尿病模型后再制作MCAO模型;E组造模完成后，在缺血2 h再灌注时按0.03 mg/kg剂量于大鼠尾静脉注射clastolactacystin βlactone;F组造模完成后缺血2 h再灌注时尾静脉注射等量生理盐水。每组6只。相同条件下，试验分批进行，每批含各组大鼠1只。在制作MCAO模型中，凡术中动物死亡、蛛网膜下腔出血或无偏瘫体征均为模型复制失败，不计在内，用同一批次的大鼠制成合格模型后补足动物数。

　　1.3 动物模型

　　1.3.1 糖尿病动物模型

　　2%STZ按60 mg/kg给大鼠腹腔注射,48 h后取鼠尾微量血测空腹(禁食禁水10 h)血糖达 16.7 mmol/L以上的大鼠，常规喂养6周，每周复测随机血糖在13.5 mmol/L以上即可确诊糖尿病[3]，入选MCAO模型。对血糖值<16.7 mmol/L的大鼠适量补充注射STZ 1～5 mg/只，并于补药3 d后再次检测血糖值，及时淘汰未达标大鼠。

　　1.3.2 局灶性脑缺血再灌注动物模型

　　糖尿病模型制作成功后，C、D、E、F组大鼠参考 Nagasawa[4]方法制作MCAO模型。缺血时间为2 h，再灌注时轻轻提拉所留线头。B组的手术过程相同，只是线栓长度为10 mm，只置于颈内动脉而未进入大脑中动脉。大鼠麻醉清醒后(约2～3 h)进行神经功能评分，按Longa EZ 5分制标准评分: 0分，无神经缺损症状;1分,不能伸展对侧前爪;2分,行走时向偏瘫侧转圈;3分,向偏瘫侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。评为0分及4分动物被剔除。

　　1.4 取材及染色

　　各组于再灌注后24 h，将大鼠深麻醉，经4%多聚甲醛PBS缓冲液灌注固定后，断头取脑。取视交叉后2 mm脑组织层面进行脱水、石蜡包埋、切片厚 4 μm。免疫组织化学采用标准SABC法，DAB显色，按试剂盒说明书进行操作;免疫染色阴性对照采用PBS液代替I抗。在额顶叶皮质，用 ImageproPlus 5.0图文分析系统测定NFκBp65免疫阳性细胞灰度值，每张切片用高倍镜随机观察皮质到白质5个不重复视野，计算NFκBp65免疫阳性细胞灰度值。

　　1.5 统计方法

　　所有数据以(x±s)表示，成组设计多样本均数比较用oneway ANOVA方差分析,多样本均数间两两比较用LSD法, 检验水准为α=0.05。 应用 SPSS 11.5统计软件进行分析。

　　2 结果

　　2.1 脑缺血再灌注24 h后血糖值

　　由表1可见，C组血糖值较D、E、F组低，P<0.05;E组的血糖值较D组稍低，但无统计学差异(P>0.05)。

　　2.2 免疫组织化学结果

　　A组和B组中未见NFκBp65免疫反应阳性细胞。脑缺血再灌注24 h后C、D、 E、F组均可见NFκBp65的免疫反应阳性细胞(细胞核染色为主)，主要分布在额顶叶皮质、基底节、丘脑、海马、梨状皮质等部位，在缺血对侧皮质和近中线结构也可见少量NFκBp65蛋白表达，主要染色在细胞浆，无明显核染色。NFκBp65表达在D组较C组增加，在E组较D组和F组减少(见图1和表1)，P<0.05，差异有统计学意义。表1 脑缺血再灌注24 h血糖和NFκBp65的灰度值比较(略)

　　3 讨论

　　泛素蛋白酶体途径作为调节蛋白质降解的重要系统[5]参与了缺血性脑损伤的病理学过程，26S蛋白酶体是其重要成分之一，它可识别并降解泛素化的IκB，从而调节NFκB的活性[1]。Clasto lactacystinβlactone的活性中间体βlactone能选性不可逆地与 26S蛋白酶体催化核心 20S上的苏氨酸结合，从而抑制 26S蛋白酶体的活性，阻断 UPP的蛋白降解途径。

　　糖尿病是脑梗死重要的危险因素，并且使脑梗死患者症状加重、预后差、死亡率高，但糖尿病时加重脑缺血损伤的具体机制仍不完全清楚。NFκB可调节多种促炎症因子的表达，被认为是炎症反应的中心环节，是脑缺血后炎症级联反应中最重要的调控因子之一。很多研究提示脑缺血再灌注后NFκB激活，加重脑缺血再灌注损伤[6～8]。糖尿病患者全身和局部炎症反应增强，血清炎性标志物大多增高，其产生的分子基础与NFκB的异常表达相关。有研究显示，无论糖尿病病程长短，患者体内多种组织均有NFκB的异常表达[9]，因此认为糖尿病加重脑缺血再灌注损伤可能与NFκB有关。

　　本研究显示，脑缺血再灌注24h后，非糖尿病组、糖尿病组、糖尿病治疗组及糖尿病治疗对照组均可见到活化的NFκBp65免疫阳性细胞表达，且在糖尿病组NFκBp65的表达较非糖尿病组增加更加明显(P<0.05)，表明糖尿病可促进NFκBp65的激活。p65亚基活化是导致炎性表达中性粒细胞活化浸润器官损伤的重要途径[10]，提示NFκB的激活是糖尿病加重脑缺血再灌注损伤的重要机制之一。

　　给予Clasto lactacystinβlactone阻断UPP后，由于阻断了Ⅰ κB的降解，使其不能与NFκB分离，从而不能释放出NFκB移位入核转录相应靶基因的表达，从而抑制NFκB的转录活性。在糖尿病治疗组，给予Clasto lactacystinβlactone阻断UPP后，NFκBp65表达明显减少，与糖尿病治疗对照组和糖尿病组比较，P<0.05，提示阻断UPP后，抑制了NFκB的激活;而这3组血糖值相比较，P>0.05，无统计学差异。提示糖尿病脑梗死再灌注大鼠阻断UPP后，使NFκB激活减少，从而减轻了NFκB调节的炎症反应，减轻脑缺血再灌注损伤，而不是通过改变血糖值而产生神经保护作用。因此认为，在糖尿病脑梗死再灌注大鼠阻断UPP后，通过抑制NFκB的激活而产生神经保护作用。

　　【参考文献】

　　[1]　Amir RE，Iwai K，Ciechanover A. The NEDD8 pathway is essential for SCF (betaTrCP) mediated ubiquitination and processing of the NFkappa B precursor p105[J].J Biol Chem，2002 (26):23253-23259.

　　[2]　Wojcik C, Di Napoli M. Ubiquitinproteasome system and proteasome inhibition: new strategies in stroke therapy[J]. Stroke, 2004 (6): 1506-1518.

　　[3]　刘磊,朱梅佳.实验性慢性糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制作[J].中国现代神经疾病杂志,2005 (1):45-50.

　　[4]　Nagasawa H,Kogure K. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke,1989 (8):1037-1043.

　　[5]　Pickart CM, Eddins MJ. Ubiquitin: structures,functions, mechanisms[J]. Biochim Biophys Acta, 2004 (1-3):55-72.

　　[6]　Wang YH, Wang WY, Chang CC, et al. Taxifolin ameliorates cerebral ischemiareperfusion injury in rats through its antioxidative effect and modulation of NFkappa B activation[J]. J Biomed Sci, 2006 (1):127-141.

　　[7]　Song YS, Lee YS, Chan PH. Oxidative stress transiently decreases the IKK complex (IKKalpha, beta, and gamma), an upstream component of NFkappaB signaling, after transient focal cerebral ischemia in mice[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2005 (10):1301-1311.

　　[8]　毛诗贤，杨期东，李振国等。阻断泛素蛋白酶体途径在大鼠脑缺血再灌注损伤中的抗炎作用[J].国际神经病学神经外科学杂志,2005 (4):298-300.

　　[9]　Pai S, Thomas R. Immune deficiency or hyperactivityNfkaooab illuminates autoimmunity[J].J Autoimmun,2008(3)：245-251.

　　[10]　杨军，胡新华，刘程伟，等.抑制核因子κB减轻腹主动脉瘤破裂所致多脏器损伤的实验研究[J].中华医学杂志，2006(4):237-241.