ING4 和HIF1α在人脑不同级别星形细胞瘤中表达的研究

　　作者：赵树鹏 牛光明 陶胜忠 张鹏远 宋 乐 尹先印 苏芳忠 作者单位：郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014

　　【摘要】 目的 研究ING4及HIF1α在星形细胞瘤中的表达，探讨它们在星形细胞瘤发生和发展中的作用。方法 采用免疫组化法检测45例星形细胞瘤标本及11例正常脑组织中ING4和HIF1α的表达。结果 ING4在正常脑组织和星形细胞瘤中的阳性表达率分别为100%、42.4%;Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤中的阳性表达率分别为58.3%、23.8%，差异均有统计学意义(P<0.05)。HIF1α在正常脑组织和星形细胞瘤中的阳性表达率分别为0、71.1%;在Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤中的阳性表达率分别为54.2%、90.5%，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 ING4和HIF1α基因的表达与星形细胞瘤分级有密切关系，在其发生和发展过程中起重要作用。

　　【关键词】 ING4;HIF1α;星形细胞瘤;免疫组化

　　Expressions of ING4 and HIF1α in different levels of the human brain astrocytomas Zhao Shupeng, Niu Guangming, Tao Shengzhong, et al. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014,China

　　【Abstract】 Objective To research the expressions of ING4 and HIF1α in astrocytoma, and explore their roles in genesis and development of astrocytoma. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expressions of ING4 and HIF1α in 45 cases of astrocytoma and 11 cases of normal brain tissues . Results The positive rates of the expression of ING4 in normal brain tissue and astrocytoma were 100%,42.4% respectively. The positive rates of the expression of ING4 in gradeⅠ～Ⅱand Ⅲ～Ⅳgrade astrocytoma were 58.3%, 23.8% respectively, the difference was significant(P<0.05).The positive rates of the expression of HIF1α in normal brain tissue and astrocytoma were 0,71.1% respectively. The positive rates of the expression of HIF1α in gradeⅠ～Ⅱand Ⅲ～Ⅳgrade astrocytoma were 54.2%,90.5% respectively, the difference was significant(P<0.05). Conclusion The expressions of ING4 and HIF1α genes have close relation to astrocytoma grade, which may play an important role in genesis and development of astrocytoma.

　　【Key words】 ING4; HIF1α; Astrocytoma; Immunohistochemistry

　　ING4基因是2003年发现的一种强的候选抑癌基因[1]，它通过抑制肿瘤血管增生、调控细胞增殖和凋亡及细胞的接触抑制等抑制肿瘤细胞的生长。缺氧诱导因子1α(HIF1α)是一种重要的转录因子,能促进肿瘤的血管生成，对肿瘤迅速增长起着重要的作用。本实验通过对45例星形细胞瘤标本中ING4和HIF1α蛋白检测，研究二者在星形细胞瘤发生和发展过程中的作用，为进一步揭示肿瘤的发病机制、诊断及治疗提供一定的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料 45例人脑星形细胞瘤均取自郑州大学第二附属医院神经外科200901～200907手术切除标本。男25例，女20例，年龄2～77岁，平均(41.8±18.3)岁。所有病例均为原发病例，术前未经放化疗。标本切除后中性福尔马林液固定保存，进行脱水、透明、浸蜡、包埋,蜡块连续切片，厚约4 μm，HE染色后观察。按照2000年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准[2]，其中Ⅰ级6例,Ⅱ级18例,Ⅲ级14例,Ⅳ级7例。把24例Ⅰ～Ⅱ级设为低度恶性实验组，21例Ⅲ～Ⅳ级设为高度恶性实验组。11例正常脑组织为对照组，取自脑外伤、脑出血、脑动静脉畸形病人内减压者。

　　1.2 方法 应用免疫组化法检测，厚约4 μm组织切片常规脱蜡，按SP盒说明进行。以PBS代替一抗作为阴性对照,兔抗人ING4多克隆抗体和兔抗人HIF1α单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，所用两种兔抗人抗体的终浓度为1∶100。

　　1.3 染色结果判定 ING4阳性表达以细胞核和或胞浆内出现棕黄色颗粒为准, HIF1α表达于胞核或胞质，但主要是核表达,呈棕黄色。参考Hiroshi等[3]提到的方法,随机选10个高倍视野,依照细胞着色密度和着色强度半定量评分：(1)染色细胞百分比:未见染色为0分,≤25%细胞染色为1分,25%～50%细胞染色为2分,>50%细胞染色为3分;(2)依阳性细胞染色强度:未见染色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分，棕褐色为3分,上述两者之和的总得分来判定结果,>2分定义为阳性表达(+),≤2分定义为阴性表达(-)。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理,统计方法采用χ2检验。检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 ING4的染色结果 ING4阳性染色细胞可见细胞核和(或)胞浆内出现棕黄色或褐黄色均质颗粒，主要位于胞核，也可见于脑胶质细胞、脑锥体细胞、血管内皮细胞及间质纤维组织。正常脑组织均见表达，明显高于星形细胞瘤中的表达，且在Ⅰ～Ⅱ级组中阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ级组，差异均有统计学意义。见表1。表1 ING4蛋白在正常脑组织和星形细胞瘤中的表达注：脑组织与星形细胞瘤比较，χ2=11.864，P<0.05;Ⅰ～Ⅱ级与Ⅲ～Ⅳ级比较，χ2=5.472，P<0.05

　　2.2 HIF1α的染色结果 HIF1α阳性表达主要定位于肿瘤细胞核，部分位于胞浆内，呈黄色或棕黄色的染色颗粒，以肿瘤坏死区边缘最为明显。正常脑组织中未见表达，明显低于星形细胞瘤中的表达，且在Ⅰ～Ⅱ级组中的阳性表达率低于Ⅲ～Ⅳ级组，经统计学处理，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。表2 HIF1α蛋白在正常脑组织和星形细胞瘤中的表达注：脑组织与星形细胞瘤比较，χ2=15.464，P<0.05;Ⅰ～Ⅱ级与Ⅲ～Ⅳ级比较，χ2=7.188，P<0.05

　　2.3 ING4和HIF1α之间的关联性 19例ING4表达阳性的星形细胞瘤中HIF1α表达阳性8例，26例ING4表达阴性的星形细胞瘤中HIF1α表达阳性24例，经χ2检验，两者呈负相关，相关系数r=-0.480。见表3。表3 ING4蛋白和HIF1α蛋白表达的关系

　　3 讨论

　　20世纪90年代,已认识到肿瘤是一种细胞周期调控异常性疾病,几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效应均与细胞生命活动异常有关[4]。ING4是生长抑制因子家族中的一个新成员，研究表明ING4能够与P300相互作用促使P53乙酰化,诱导细胞发生G2/M期周期阻滞，抑制细胞生长和诱导细胞凋亡，且ING4还能抑制肿瘤血管的生成。ING4基因的缺失或突变，与多种肿瘤的形成有关。Suwon Kim等[5]通过比较基因组杂交技术(CGH)分析了ING4基因周围的缺失程度,发现T47D乳腺导管癌至少有两个拷贝的缺失。另外，Garkavtsev等[6]采用实时RTPCR的方法对50例神经胶质瘤和5例正常对照脑组织中ING4基因mRNA水平进行检测，结果显示ING4基因在神经胶质瘤中的表达下降，且与肿瘤恶性程度有关，级别越高表达水平越低。本实验结果与此一致。ING4蛋白在星形细胞瘤中表达降低，且与恶性程度呈负相关，提示ING4基因由于在星形细胞瘤中的缺失和突变，使肿瘤血管生成增多，细胞增殖加速和凋亡减少，是星形细胞瘤发病的关键因素。ING4有可能成为一个基因治疗的候选分子，通过对其表达的调控，进而有效地控制星形细胞瘤的发生发展。

　　HIF1α是一种重要的转录因子，可以诱导肿瘤细胞耐受缺氧状态，促进肿瘤血管的生成。研究表明HIF1α对VEGF及多种糖酵解酶起着转录调控作用,并促进肿瘤生长,与恶性肿瘤的关系密切。Zagzag等[7]对30例不同级别的胶质瘤和10例血管母细胞瘤研究发现高恶性胶质瘤比低恶性者的HIF1α表达强。同时Zhong等[8]对10例正常脑组织进行免疫组化染色,发现HIF1α蛋白表达均为阴性。本实验检测结果与此相符,并发现HIF1α蛋白在肿瘤缺氧坏死区边缘最为明显，且以高度恶性组多见,提示肿瘤细胞局部的缺氧使HIF1α基因转录，可以对下游基因VEGF及多种糖酵解酶起调控作用,促进肿瘤血管生长,在肿瘤细胞增殖、浸润和转移过程中起重要作用。

　　近期有文献报道ING4可通过抑制HIF1α的活性，减少IL8的表达，抑制肿瘤血管的生成，但具体机制尚不清楚，在星形细胞瘤中尚未见报道。2005年，Ozer等[9]发现ING4水平和细胞内低氧状态下诱导产生的HIF1α靶基因的表达呈负相关。结合本实验，在ING4阳性表达的星形细胞瘤标本中，HIF1α趋向为阴性表达，呈负相关(r=-0.480)。由此我们可以推测可能存在这一机制，ING4通过抑制HIF1α的活性，使其失去对下游基因VEGF及多种糖酵解酶的调控作用和减少IL8的表达，来减少肿瘤血管的生成，抑制肿瘤细胞的生长。总之，ING4的失活和HIF1α的激活共同参与了星形细胞瘤的发生和发展过程，但二者之间的相互作用机制有待进一步研究证实。进一步认识ING4和HIF1α在星形细胞瘤发病中的作用,可为肿瘤的治疗提供新靶点及新思路。

　　【参考文献】

　　[1] Shiseki M,Nagashima M,Pedeux RM,et al. P2ING4 and P28ING5 bind to P53 and P300,enhance P53 activity[J].Cancer Res,2003,63(10):2 3732 378.

　　[2] Kleihues P,Cavenee WR.WHO classification of tumors pathology and genetics of tumors of the nervous system[J]. Lyon IARC Press,2000,1:253.

　　[3] Hiroshi K,Noriharu S，Shosaku A.Thymidine phosphorylase and vascular end dothelial growth factor in patients with stageⅠlung adenocarcinoma[J]. Cancer,2002,94:1 083.

　　[4] 郑杰，宋来君，孙红卫，等.Skp2和PTEN 在人脑星形细胞瘤中的表达及临床意义[J].中国实用神经疾病杂志,2008,11(1):911.

　　[5] Kim S,Chin K,Gray JW,et al.A screen for genes that suppress loss of contact inhibition: Identification of ING4 as a candidate tumor suppressor gene in human cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(46):16 25116 256.

　　[6] Garkavtsev I,Kozin SV,Chernova O，et al.The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumour growth and angiogenesis[J].Nature，2004，428(6980):328332.

　　[7] Zagzag D,Zhong H,Scalzihi JM ,et al.Expression of hypoxia inducible factor 1 alpha in brain tumors:association with angiogenesis,invasion, and progression[J].Cancer,2000,88(11):2 6062 618.

　　[8] Zhong H,De MarzoA M,Laughner E,et al.Overpression of hypoxiainducible factor 1 alpha in common human cancers and their etastases[J].Cancer Res,1999,59(22):5 8305 835.

　　[9] Ozer A，Wu LC，Bruick RK.The candidate tumor suppressor ING4 represses activation of the hypoxia inducible factor(HIF)[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005，102(21)：7 4817 486.