PLGA-地塞米松缓释剂的合成及脑内局部应用研究

作者：马晓东,郭小明,张纪,周定

作者单位：中国人民解放军总医院神经外科， 北京 100853

   【摘要】  目的 合成地塞米松缓释剂，探讨局部应用地塞米松的可行性。 方法 采用国外进口乳酸-聚羟基乙酸共聚物 （PLGA），以溶解挥发法制备PLGA-地塞米松缓释剂。体外进行PLGA-地塞米松微球载药率测定，从而得到合适浓度的微球，继而制成10 mg和4 mg两种规格的缓释片，并对缓释片的载药率进行筛选。将制成的缓释片植于大鼠颅内，经高压液相法测定出不同部位及不同时间的脑组织药物释放率。 结果 制得的PLGA-地塞米松微球中地塞米松磷酸钠 （DSP） 的载药量为6.1% （W／W）。DSP－PLGA缓释微球10 mg片第1个小时释放出130 μg DSP，之后释放速率趋向平稳，至第7天仍有20 μg／d释出；4 mg片第1个小时释出40 μg DSP，至第7天仍有少量释出。10 mg缓释片组体内释放实验结果显示：1，2，6，24，72和168 h脑内药物含量分别为38.49，21.34， 16.72，11.52，6.31和0.51 μg /g。 结论 PLGA可以很好地缓慢控释地塞米松；在脑内局部应用DSP-PLGA，可以得到较高的局部有效药物浓度，并被脑组织很好地耐受。

【关键词】  地塞米松 迟效制剂 乳酸-聚羟基乙酸共聚物 （PLGA）

    Synthesis of slow-release PLGA-dexamethasone and research of its local brain application

    MA Xiaodong, GUO Xiaoming, ZHANG Ji, et al

    Department of Neurosurgery, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

    Abstract:  Objective  To synthesize the slow-release dexamethasone, and investigate the feasibility of its partially application.  Methods Solvent evaporation method was used to make DSP (Dexamethasone sodium phosphate)-PLGA (polylactic-co-glycolic acid) polymer. In vitro the loading ratio was measured and got the appropriated concentration. The 10mg and 4mg polymer tablets were made. After the selection of the tablets concentration, the tablets were delivered to rat brain and the releasing rate at different areas and different time in the brain was measured by high performance liquid chromatography (HPLC).  Results  The loading rate of dexamethasone sodium phosphate is 6.1% (W/W). The first hour releasing of 10mg DSP-PLGA tablets was 130μg, after then the releasing rate got placidity. There are 20μg/d DSP was released up to the 7th day. The first hour releasing of 4mg DSP-PLGA tablets was 40μg, and there still remain some at the 7th day. In vivo the 10mg DSP-PLGA tablets got 38.49, 21.34, 16.72, 11.52, 6.31 and 0.51μg/g remain in the brain tissue after 1, 2, 6, 24, 72 and 168hs releasing.  Conclusion  PLGA can control the releasing of dexamethasone well. A very high local concentration can be got by local brain delivering of DSP-PLGA. It can be tolerated well by the brain and has potential mean for a new way of local application of dexamethasone.

    Key words:  dexamethasone;  delayed-action preparations;  polylactic-co-glycolic acid (PLGA)

    脑内局部应用糖皮质激素治疗脑水肿，是避免大剂量使用糖皮质激素，从而减少其危害的有效途径[1]。乳酸-聚羟基乙酸共聚物 （PLGA） 是新型的前景看好的缓释剂[2]，本研究拟以地塞米松磷酸钠 （DSP） 为主药，PLGA作为缓释载体，合成地塞米松缓释剂，并探讨其局部应用的可行性。

   1    材料与方法

    1.1    DSP-PLGA缓释剂制备及参数测定    以DSP （国产） 和PLGA （日本） 为原料 （1∶9），采用溶解挥发法制备DSP-PLGA缓释微球，制备方法见参考文献[1]。用所得DSP缓释微球压片，得到10 mg/片、4 mg/片两种规格的DSP缓释片剂。用光学显微镜、扫描电镜对DSP－PLGA微球进行观察研究，评估微球的一般形态特征。取DSP标准品，用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液 （PBS） 配成2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μg/ml等7种不同浓度的标准液。用紫外分光光度计在242 nm波长下测定吸收值，得到PBS液中DSP浓度的标准曲线。

    取50 mg DSP－PLGA微球溶解在50 ml pH 7.4的PBS中，震荡混匀后，过滤并冲洗，用紫外分光光度计检测滤液中DSP含量。剩余微球溶于5 ml二氯甲烷，再加入pH 7.4的磷酸缓冲液50 ml，充分震荡，过滤、冲洗，紫外分光光度计检测溶液中DSP含量。合并两者中DSP含量，得到微球的载药量。

    分别取滤膜包裹的10 mg缓释微球、10 mg和4 mg片剂置于10 ml pH 7.4的PBS液中，37 ℃恒温水浴。定时移出微球，测量缓冲液中DSP含量，移出的微球 （或片剂） 放入新缓冲液中继续测试。

    1.2    DSP－PLGA缓释片体内释放实验

    1.2.1    动物分组：　   成年雄性SD大鼠18只 （由304医院动物实验室提供），体质量250~300 g。随机分为6组，每组3只。取10 mg缓释片用紫外线灯照射1 h，备用。

    1.2.2    模型制作：　   采用氯胺酮100 mg／kg和速可眠1 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，立体定向头架固定大鼠头颅，行无菌开颅手术。暴露颅骨，以矢状缝左侧3 mm、人字缝前3 mm为中心，开直径6 mm的骨窗，切开硬膜，将10 mg的缓释片植入骨窗。止血后，缝合头皮。

    1.2.3　   标本取样：　   在缓释片植入后1、2、6、24、72、168 h共6个时间点进行检测。断头处死大鼠，取左侧大脑半球，去除缓释片残片，用生理盐水冲洗大脑表面。滤纸吸干水分后，把大脑半球水平切分为等厚的三层脑块，紧贴缓释片的顶层记为A层，脑底层标记为C层，中间层标记为B层。

    1.2.4　   样品准备：　   脑块分别称重、匀浆，加入生理盐水至2 ml，各加入内标泼尼松龙1 μg。加入1 mol/L的NaOH溶液0.5 ml，充分混匀。用庚烷5 ml洗涤匀浆液，保留水溶液。用乙酸乙酯萃取水溶液，充分震荡。5 000 r/min离心15 min后，移出乙酸乙酯，吹干，残渣待测。

    1.2.5　   含量测定：　   采用高效液相色法 （HPLC），色谱柱为流动相甲醇－水－38%乙酸 （65∶35∶2），流速1 ml/s。用对照脑组织匀浆液配制含内标泼尼松龙1 μg/ml的不同浓度地塞米松标准品液，浓度分别为0.5、1、2、4、6、8 μg/ml。经HPLC测定，计算地塞米松与内标泼尼松龙峰面积比，制作标准曲线。取制备的标样，每份用50 μl流动相溶解，以12 000 r/min离心15 min，取上清液20 μl进样，测定标样中地塞米松和内标的峰面积。按照标准曲线，计算出样品中地塞米松的含量。

    2 　  结    果

    2.1　   DSP－PLGA缓释微球形态特征    DSP－PLGA微球为白色粉末，光镜下呈光滑的瓷白色球状体，平均直径为 （29.93 ± 4.10） μm。扫描电镜下呈表面粗糙的球状体；释放24 h后，可显示微球内部的蜂窝状结构。

    根据实验要求，DSP－PLGA微球被压成10 mg和4 mg两种规格的片剂，其中10 mg片剂为圆形薄片，直径5.0 mm，厚1.0 mm，质量10.0~10.4 mg/片；4 mg片剂为椭圆形，4.0 mm × 2.5 mm × 1.0 mm，质量4.0~4.4 mg/片。

  2.2　   缓释微球载药量    测得微球中DSP的载药量为6.1% （W/W）。

    2.3　   体外释放特性    DSP－PLGA缓释微球存在突释效应，第1个小时有35%的DSP释出，至48 h有95%释出 （图1）。

    DSP－PLGA片剂释放实验示10 mg片第1个小时释放出130 μg DSP，其后释放速率趋向平稳，至第7天仍有20 μg/d释出；4 mg片第1个小时释出40 μg DSP，至第7天仍有少量释出 （图2）。10 mg缓释片的体内释放实验结果如表1所示。

    3    讨    论

    PLGA是由多聚乳酸 （PLA） 和多聚羟基乙酸 （PGA） 以不同比例嵌合而成的高分子聚合物，由于酯键不稳定，在体内可重新水解为乳酸和羟基乙酸，最终代谢为水和二氧化碳排出体外。PLGA具有低免疫反应、良好的生物相容性及可生物降解等优良特性，最早用于可吸收缝合材料、骨科和牙科替代材料的加工制造，近10年来，其作为控释、缓释药物辅料被广泛使用。

    PLGA的降解速度与其内部PLA和PGA的比例有关，一般认为，PLA和PGA的比例为50∶50时降解速度最快。PLA富含疏水基团，故PLGA中PLA含量越高，疏水性越强，降解越慢。此外，PLGA的分子量大小、微球大小及PLGA的聚合物玻璃化温度 （Tg） 高低等因素均影响PLGA微球的降解速度。PLGA在体内水解不需要酶参与，生成的乳酸、羟基乙酸经过三羧酸循环最终生成水和二氧化碳排出体外。根据缓释剂主药的理化特点、代谢特征及临床需要的不同，通过调节缓释辅料PLGA中PLA和PGA的组成比例，可得到符合缓释要求的药物缓释制剂。

    DSP是临床最常用的糖皮质激素制剂，性质稳定，价廉易得，在体内半衰期为5 h。DSP为水溶性药物，其缓释微球的释放速度远快于脂溶性地塞米松，释放时间较短，更符合脑水肿治疗对缓释剂的要求。研究证明：DSP液持续灌注蛛网膜下腔，脑脊液内存在地塞米松钠盐和活性地塞米松两种形式，两者维持相对稳定的药物浓度，灌注超过4周仍无毒副作用和不良反应发生[3~5]。

    本研究通过溶解挥发法制备DSP和PLGA缓释微球，平均直径为 （29.93 ± 4.10） μm， 符合我国药典关于药物载体粒径在1~250 μm之间称为微球的规定。其载药率为6.1%，扫描电镜示DSP-PLGA缓释微球表面呈粗糙的球状体，内部为微孔结构。根据脑水肿的病理生理转归过程，用于脑水肿治疗的地塞米松缓释剂有效释药时间以接近1周为宜。DSP以结晶形式分散在PLGA微球中，遇水溶解后即可通过微球内部的蜂窝状微孔和毛细管道渗透扩散释出，并不依赖于载体本身完全水解，故释放速度较快。本实验所制备的DSP-PLGA缓释微球的体外释放实验结果显示：在恒温37 ℃磷酸缓冲液中释放48 h后，已有95%药物释出；释药曲线显示缓释剂释放过程存在突释现象，属非恒速释放。通过改变剂型可影响药物的缓释特性，DSP-PLGA缓释微球被压制成DSP-PLGA片剂后，有效延长了释药时间，可持续释药6 d左右，达到了实验设计要求。

    突释效应是微球普遍存在的现象，主要由表面吸附的药物快速释放所致。我国药典规定：缓释微球的突释效应在0.5 h内不应超过40%。实验中DSP被制成缓释微球后，将按一级速率规律释放DSP，持续释药时间超过48 h。由于糖皮质激素治疗脑水肿时通常采用“大剂量冲击疗法”，故药物的突释效应有利于在极短时间内达到有效药物浓度。另外，糖皮质激素用于治疗脑水肿时，用药越早治疗效果越好，故适度的药物突释效应有助于提高治疗效果。

    血脑屏障使亲水或大分子药物难以进入中枢神经系统发挥其药效。使药物能通过血脑屏障的常用方法包括：增加药物脂溶性，微导管局部灌注，药物棉球直接贴附，局部植入控释、缓释剂等。其中控释、缓释药物一旦植入后，即不再需要进行进一步干预，可保持持续而稳定的药物释放，是最有前途的给药方案。

缓释剂植入脑局部后，药物向脑组织的转移释放是个复杂过程，药物分子通过扩散进入脑组织，扩散的最大阻力来自植入体与组织交界面。药物分子向脑组织扩散的能力与药物浓度梯度、间质液对流 （决定于细胞外液的流动速度） 成正比。在药物分子进入组织间质后，大部分可能被组织清除，如被酶降解、与蛋白结合；另外，一部分药物分子进入细胞内，而不能在靶位结合发挥作用，故药物进入组织的过程，是个动态变化的过程。不同药物对脑组织的“穿透能力”决定于其化学结构、物理特点和生物学特点。地塞米松在脑组织内的扩散能力，远远优于其他局部常用药物，如抗肿瘤药、神经生长因子等。

    体内释放实验结果表明：DSP-PLGA缓释片植入后，形成了一个以受伤灶为中心的稳定的局部高地塞米松环境。植入缓释片1 h，顶部挫伤部位脑组织的地塞米松含量最高，平均为39 μg /g；脑组织中地塞米松含量分布由上向下呈递减分布，顶部最高，脑底最低。释药曲线显示：脑组织中地塞米松含量保持平缓下降的趋势，颅内释药1周时，测得脑组织中地塞米松浓度仍达0.51 μg /g。脑组织中地塞米松的总体水平与相关文献报道相吻合，消除了间断给药方式常出现的药物浓度水平的“峰谷”样波动，使脑组织中地塞米松浓度相对保持稳定，从而维持有效的“治疗窗”。

【参考文献】  [1] 周永春, 杨开军, 漆松涛, 等. 地塞米松脑内缓释对脑水肿和氧化氮合酶的影响 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2005; 10(11): 512-513.

[2] Eroglu H, Kas HS, Oner L, et al. The in-vitro and in-vitro characterization of PLGA:L-PLA microspheres containing dexamethasone sodium phosphate [J]. J Microencapsul, 2001; 18(5): 603-612.

[3] Hortobagyi T, Hortobagyi S, Gorlach C, et al. A novel brain trauma model in the mouse: effects of dexamethasone treatment [J]. Pflugers Arch, 2000; 441(2-3): 409-415.

[4] Jain RA, Rhodes CT, Railkar AM, et al. Controlled delivery of drugs from a novel injectable in situ formed biodegradable PLGA microsphere system [J]. J Microencapsul, 2000; 17(3): 343-362.

[5] 马晓东, Dillehay LE, Williams JR, et al. 局部缓释IUdR治疗恶性星形细胞瘤实验研究 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2005; 4(4): 293-298.