伏隔核毁损对MAP模型大鼠行为及脑内DA受体的影响

　　作者：王晓峰 李拴德 刘建新 李　 鑫 作者单位：中国人民解放军第三医院神经外科， 陕西 宝鸡 721004

　　【摘要】 目的 探讨立体定向伏隔核毁损对甲基苯丙胺 (MAP) 模型大鼠行为学及不同脑区多巴胺D2受体表达的影响。 方法 将80只SD大鼠随机分为对照组、模型组、假手术组和手术组，每组各20只。经腹腔注射MAP制备精神分裂症模型，采用立体定向-直流电毁损伏隔核，观察大鼠刻板行为变化;并采用原位杂交法观察额叶、颞叶、边缘区及脑干部位的D2受体表达。 结果 与对照组比较，模型组及假手术组大鼠刻板行为评分及各个脑区D2受体表达均显著性增加; 与模型组及假手术组比较，手术组大鼠刻板行为评分及各脑区DA受体阳性细胞数目均显著性减少。 结论 伏隔核毁损可能通过抑制MAP诱发的脑内D2表达亢进而改变其行为学异常。

　　【关键词】 精神分裂症 甲基苯丙胺 伏核 受体 多巴胺D2

　　The effect of nucleus accumbens lesion on behavior and expression

　　of cerebral dopamine receptor in methamphetamine-treated rats

　　WANG Xiaofeng, LI Shuande, LIU Jianxin, et al

　　Department of Neurosurgery, 3rd Hospital of PLA, Baoji 721004, China

　　Abstract: Objective To explore the effects of stereotactic lesion to the nucleus accumbens on the behavior and expression of dopamine receptor D2 (DRD2) in special areas of the brain in methamphetamine (MAP)-treated rats. Methods Eighty Sprague-Dawley rats were equally divided into four groups: normal control (NC), MAP-treated alone, MAP + sham-lesioned, and MAP + lesion to the nucleus. The rat model of schizophrenia was prepared by MAP injection i.p. and the nucleus lesioned by direct current to observe the changes in stereotypic behavior of MAP + lesion rats. Expressions of DRD2 in the prefrontal lobe and temporal lobe and limbic system and brain stem were then detected by in situ hybridization. Results Compared with the control group, there were remarkable behavior changes and increase of DRD2 expressions in the above mentioned areas in the MAP-treated alone and MAP + sham-lesioned groups; and compared with MAP-treated alone and MAP + sham-lesioned groups, the score of the behavior and DRD2 expression was decreased obviously. Conclusion Nucleus accumbens lesion can improve stereotyped behavior in MAP rats, which may be due to restrain the hyperexpression of DRD2 induced by MAP.

　　Key words:　 schizophrenia; methamphetamine; nucleus accumbens; receptors, dopamine D2

　　伏隔核在中脑边缘系统的多巴胺 (DA) 受体对情感、行为、运动、记忆具有重要的闸门作用，可能参与精神分裂症的产生。本研究采用立体定向毁损精神分裂症模型大鼠的双侧伏隔核，观察行为学改变及DA受体的调控作用，以探讨精神外科治疗的理论基础，为临床治疗探寻更有效的新靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组 雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体质量180~220 g (西安交通大学医学院实验动物研究中心提供)，随机分为对照组、模型组、假手术组和手术组 (伏隔核毁损组)，每组各20只。实验前室内分笼饲养1周，自由进食，给予自然节律光照。

　　1.2 模型制备及行为学观察 模型组、假手术组和手术组大鼠经腹腔注射甲基苯丙胺 (MAP) 10 mg / kg × 15 d，对照组注射同等剂量生理盐水。各组大鼠刻板行为评分参照Sams-Dodd评分标准：0分：静止不动，几乎或根本没有活动;1分：正常活动，偶有向前运动;2分：活动伴随反复向前探索;3分：持续向前探索;4分：重复抬头、摇头或旋转;5分：迅速摇头、旋转或带摇头的背腹运动。每10 min评分1次，并记录刻板行为持续时间。以刻板行为评分≥2分，刻板行为持续时间≥15 min为合格模型判定标准。

　　1.3 手术方法 手术组大鼠在给药第16天，以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉后固定于动物立体定位仪上 (Narishige公司)，将齿杆调至耳杆下3.3 mm，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨表面组织。牙科钻开颅，将直径0.25 mm、尖端裸露0.5 mm的射频电极 (FHC公司) 尖端插入伏隔核，用毁损仪 (Nihonkohden公司) 进行毁损，毁损电流1 mA;核团坐标参照标准大鼠图谱，即前囟前1.8 mm，中线旁开1.2 mm，深度距颅骨表面6.5 mm;通电时间45 s。以骨蜡填补缺损颅骨，缝合皮肤后，正常笼养。假手术组仅做皮肤切开，分离暴露颅骨。术后7 d恢复MAP给药及刻板行为评分，持续7 d。

　　1.4 原位杂交染色 D2受体探针及原位杂交试剂盒均购自武汉博士德公司。各组大鼠给予2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔麻醉后开胸，先用100 ml生理盐水经左心室灌注以冲净血液，再用预冷的4%多聚甲醛/ 0.1 mol/L磷酸缓冲液 (PBS) (含0.1%焦碳酸二乙酯、DEPC) 500 ml灌注，然后取全脑，用4%多聚甲醛/ 0.1 mol/L PBS (含0.1%DEPC) 固定1 h。常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度8 μm，玻片采用多聚赖氨酸处理。切片经常规脱蜡至水。3%双氧水室温下处理5~10 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 (1 ml柠檬酸+ 2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37 ℃或室温消化20 min，原位杂交用PBS洗3次 × 5 min。蒸馏水洗1次。1%多聚甲醛/ 0.1 mol/L PBS (PH 7.2~7.6，含0.1%DEPC) 室温固定10 min。蒸馏水洗涤3次。每张切片加20 μl预杂交液。置38 ℃恒温箱内4 h。吸取多余液体，不洗。每张切片加20 μl杂交液。将原位杂交专用盖玻片盖在切片上。恒温箱38 ℃杂交过夜。揭掉盖玻片，37 ℃下以 2 × SSC洗涤5 min × 2次，0.5 × SSC洗涤15 min × 1次，0.2 × SSC洗涤15 min × 1次。滴加封闭液，37 ℃ 30 min后甩去多余液体，不洗。加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃ 60 min。原位杂交用PBS洗5 min × 3次。滴加SABC，37 ℃ 20 min。原位杂交用PBS洗5 min × 3次。加生物素化过氧化物酶，37 ℃ 20min，原位杂交用PBS洗5 min × 4次。1 ml蒸馏水加DAB显色剂A、B、C各1滴，混匀，加于标本上。一般显色20 min，充分水洗。苏木素复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明封片。

　　1.5 结果观察及统计学分析 每张片观察10个400倍视野。采用Motic MED 6.0真彩色数码医学图像分析系统自动计算阳性和阴性细胞数及阳性细胞比例。实验结果采用SPSS 10.0 统计软件进行分析，以均数 ± 标准差表示，均数间的比较采用独立样本t检验。

　　2 结 果 (图1)

　　模型组和假手术组大鼠刻板行为评分、额叶、颞叶、边缘区及脑干部位D2受体表达均显著性高于对照组。手术组大鼠刻板行为评分，刻板行为持续时间，额叶、颞叶、边缘区及脑干部位D2受体表达均显著性低于模型组及假手术组，刻板行为潜伏期显著性高于模型组及假手术组。与对照组比较，手术组大鼠刻板行为评分、额叶、颞叶、边缘区及脑干部位D2受体表达无显著性差异 (表1)。

　　3 讨　 论

　　3.1 伏隔核参与精神分裂症的发病 伏隔核亦称伏核，分为新月形的壳部和背外侧的核部，两者与脑的其他结构存在广泛联系。壳部的传出纤维传至腹侧苍白球腹内侧，延伸至杏仁核、外侧视交叉前区、腹内核、中脑腹侧背盖区、外侧下丘脑、背内侧黑质致密部及脑桥中间网状结构。核部发出纤维投射到苍白球背外侧、腹内侧核、中脑背盖外侧和黑质。伏隔核接受前脑的传入纤维和脑桥区的投射纤维，是把情感、记忆转化为运动和活动的神经介面，即边缘-运动的接口[1]。

　　有关精神分裂症分子机制的研究中，现仍以DA功能亢进假说最受重视，其中又以中脑向边缘投射中的伏隔核DA系统最引人关注。因为伏隔核及其相关结构是处理与情感有关信息的闸门，中脑边缘系统的DA调控着通过这一闸门的神经信息流。伏隔核及此系统的其他投射区均接受来自海马和杏仁核的传出纤维，然后再发出纤维投射至隔区、下丘脑和额叶，即精神分裂症的相关脑区。电镜观察示精神分裂症病人伏隔核神经元和神经胶质细胞总数显著减少，为伏隔核参与精神分裂症的发病提供了形态学依据[2]。对精神分裂症的研究表明：阳性症状精神分裂症的发生与“潜在抑制”的破坏有关;大鼠由于伏隔核DA的过度释放而引起“潜在抑制”破坏，与有阳性症状精神分裂症病人“潜在抑制”的破坏具有相似性，而伏隔核DA被阻滞时“潜在抑制”加强。这一研究与我们在临床及基础研究中发现的精神分裂症病人及模型动物的DA代谢紊乱具有相似结果[2，3]。因此，伏隔核在参与精神分裂症的发病上可能具有十分重要的意义。

　　3.2 伏隔核具有调控DA受体平衡和控制大鼠刻板行为的作用 目前，抗精神病药物主要通过影响脑内神经元突触间单胺类N递质的功能而发挥作用，各种高效价的抗精神病药物均是强有力的DA受体阻滞剂。抗精神病药物作用的位点有两个：①D2受体，这是抗精神病药物的主要作用位点，可减弱DA的传递效应。②DA神经元的抑制性自身受体，控制着过多DA的过量释放。研究表明：中枢DA功能与人类精神活动非常密切，特别是中枢边缘系统DA功能亢进，可能与精神分裂症的阳性症状有关，而前额叶DA功能不足则可能与精神分裂症的阴性表现有关。

　　抗精神病药物是通过阻滞DA受体而发挥作用的，其效价与D2受体阻滞效应呈线性关系。本组采用MAP制作精神分裂症大鼠模型，观察毁损双侧伏隔核对大鼠的行为及D2受体改变，结果表明：模型组和假手术组大鼠刻板行为评分，额叶、颞叶、边缘区及脑干部位D2受体表达均显著性高于对照组;手术组大鼠刻板行为评分，刻板行为持续时间，额叶、颞叶、边缘区及脑干部位D2受体表达均显著性低于模型组及假手术组，刻板行为潜伏期显著性高于模型组及假手术组。与对照组比较，手术组大鼠刻板行为评分，额叶、颞叶、边缘区及脑干部位D2受体表达无显著性差异。这一研究结果与精神分裂症DA亢进假说一致，说明立体定向术毁损MAP大鼠模型双侧伏隔核可使其多巴胺D2受体含量下降，且由MAP诱导的刻板行为和社会行为可得到明显改善。本实验结果提示：伏隔核有调控DA代谢紊乱[4]及D2受体平衡的作用，立体定向毁损MAP精神分裂症大鼠模型的治疗效果是通过调控DA代谢紊乱，抑制D2受体而发挥作用的。因此，D2受体基因很可能参与精神分裂症的发病，而伏隔核很可能是外科治疗精神分裂症一个有效的重要靶点。

　　【参考文献】

　　[1] Varma TR, Fox SH, Eldridge PR, et al. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus: effectiveness in advanced Parkinson's disease patients previously reliant on apomorphine [J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2003; 74(2): 170- 174.

　　[2] 李拴德, 李涛, 王晓峰, 等. 杏仁核和扣带回毁损对Ⅰ型精神分裂症患者脑脊液单胺递质的影响 [J]. 西安交通大学学报 (医学版), 2002; 23(6): 598-599.

　　[3] 李拴德, 马文涛, 杨来启, 等. 立体定向毁损杏仁核对大鼠脑内单胺递质影响的实验研究 [J]. 西北国防医学杂志, 2004; 25(4): 257-259.

　　[4] 尹乾坤, 李拴德, 王晓峰, 等. 大鼠伏核毁损后行为和学习记忆能力的变化 [J]. 中国行为医学科学, 2004; 13(l): 23- 25.