降钙素基因相关肽与内皮素受体A在兔实验性蛛网膜下腔出血后基底动脉的表达

　　作者：宋锦宁，张明，梁琦，隋龙，王文博，郗 磊 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管内皮细胞降钙素基因相关肽(CGRP)及内皮素受体A(ETRA)的表达与迟发性脑血管痉挛(DCVS)之间的关系。方法 日本大耳白家兔60只，随机分为SAH模型组25只，盐水组25只，穿刺组5只，正常组5只。采用枕大池二次注血法制作SAH模型，灌注处死后取基底动脉制成切片。进行CGRP及ETRA的免疫组化和HE染色，观察CGRP与ETRA的免疫表达和病理结构变化，并用图像分析方法测量血管周长，使用方差分析进行统计学检验。结果 基底动脉周长在SAH后均发生明显缩窄，其中在5 d时缩小最强烈。CGRP与ETRA免疫阳性标记颗粒在SAH组的基底动脉组织中均有表达，其动态变化规律为CGRP的表达在1 h时最明显，在3、5 d依次表达减少，5 d达到最低点，7 d后开始逐渐升高，10 d时表达相对比较明显，但未能达到正常水平，CGRP在穿刺组、正常对照组和盐水组也有散在不规则表达。在正常组、穿刺组和盐水组的基底动脉内ETRA有表达;SAH组基底动脉内ETRA在3 d组和5 d组表现为高表达，以3 d组为强，而其中血管内皮细胞表达最强烈，平滑肌也有表达，10 d组的表达仍然较强。结论 在SAH后脑血管内皮细胞CGRP和ETRA的表达呈现明显的动态改变，但二者的变化趋势并不同步;CGRP和ETRA在DCVS的发生发展中起重要的作用。

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血;脑血管痉挛;降钙素基因相关肽;内皮素受体A;免疫组织化学

　　Expression and significance of CGRP and ETRA in the basilar arteryafter subarachnoid hemorrhage in a rabbit model

　　Song Jinning, Zhang Ming, Liang Qi, Sui Long, Wang Wenbo, Xi Lei

　　(Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To discuss the relationship between the expression of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and endothelin receptor A (ETRA) in the cerebral vessels cells with delayed cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage (SAH). Methods A total of 60 Japanese white rabbits were randomly divided into four groups: 25 in SAH group, 25 in normal saline group, 5 in puncture group and 5 in normal group. An experimental SAH was induced by intracisternal injection of arterial blood in rabbits. The animals were sacrificed for perfusion fixation and the basilar arteries were made in paraffin section. The basilar arteries were removed for immunohistochemistry and HE staining, and then the immunohistochemical expression and changes of pathological structure were observed. We used image analysis system to measure the vessel perimeter and ANOVA for statistical analysis. Results The anteroposterior perimeter of basilar arteries was obviously coarctated after injecting arterial blood; there were CGRP and ETRA immunohistochemical positive staining granula expressions in the basilar artery tissues. Its dynamic change regularity was as follows: the expression of CGRP was the most obvious at 1 h, and decreased from day 3 to day 5 by turns, then on days 5 reached the lowest; it began to increase from day 7, the expression on day 10 was relatively obvious, but did not reach the normal level. There was scattered irregular positive staining in the normal saline group and puncture group. ETRA was expressed on the basilar artery both in blank group and puncture group. They were expressed mainly on the vascular endothelial cells. ETRA was also　expressed on the basilar artery in the saline group. ETRA was expressed heavily on the basilar artery’s endothelial cells in SAH group, mainly in 3-day subgroup. Smooth muscle cells also expressed ETRA. Conclusion The expression of CGRP and ETRA in the cerebral vessel cells after subarachnoid hemorrhage presents obviously dynamic changes; and it is suggested that CGRP plays a very important role in the delayed cerebral vasospasm.

　　KEY WORDS: subarachnoid hemorrhage; cerebral vasospasm; calcitonin gene-related peptide; endothelin receptor A; immunohistochemistry

　　迟发性脑血管痉挛(delayed cerebral vasospasm, DCVS)是蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)最常见的病理改变之一。但是，其发病机制目前仍不十分清楚。近年来的研究发现[1-3]，内皮素-1(endothelin-1, ET-1)可以特异性的和内皮素受体A(endothelin receptor A, ETRA)结合，引起血管的强烈收缩，而降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)却具有拮抗ET-1的收缩作用。但是，目前有关CGRP的相关研究均测定的是血液或脑脊液中CGRP水平的变化[4-5]，而其在脑血管内皮上的表达情况，尤其是与ETRA表达的对照研究较少。本实验采用枕大池二次注血法建立兔SAH后DCVS模型，旨在探讨SAH后CGRP与ETRA在在脑血管表达的动态变化规律，进一步阐明SAH后DCVS的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验动物为日本大耳白家兔，60只，雌雄不拘，健康状况良好，体重2.1-2.9(2.5±0.4)kg，在相同的条件及环境中(饲料和温度均相同)饲养一周后进行实验。所有实验用兔均购自西安交通大学医学院实验动物中心。

　　实验试剂及药品：CGRP一抗、兔抗兔ETRA单克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司;40 g/L多聚甲醛灌注液购自西安交通大学医学院器材科;250 g/L乌拉坦溶液、0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液、PBS缓冲液以及修复液均由西安交通大学医学院组织胚胎与解剖实验室提供;手术器械等由西安交通大学医学院第一附属医院神经外科提供。

　　1.2 实验分组

　　动物随机分组：SAH模型组25只，盐水对照组25只，穿刺对照组5只，正常对照组5只。SAH模型组根据建立模型后的不同时间段分为5个亚组，分别是：建模后1 h组、3 d组、5 d组、7 d组和10 d组。每个亚组5只动物。盐水对照组亦根据注水后不同时间段分为5个亚组，分别是：注水后1 h组、3 d组、5 d组、7 d组和10 d组。每个亚组5只动物。

　　1.3 动物模型的建立

　　采用枕大池二次注血法，间隔48 h，制成兔SAH模型：①用250 g/L乌拉坦经兔耳缘静脉注射麻醉，初次麻醉剂量为3 mL/kg，2次麻醉时剂量减为2mL/kg。②动物麻醉好之后将其俯卧位，在耳正中动脉用注射器抽取5 mL血液，血液抽出后要轻微振荡防止其凝固。③将兔颈部剃毛并将四肢躯干固定，触摸到枕大孔边缘后切开大约2.5 cm的手术切口,逐层钝性分离颈部肌肉至可触摸到枕大孔骨缘和第二颈椎棘突。用18G套管针经环枕筋膜穿刺枕大池，为了模拟出真实SAH尽量不放出脑脊液。④迅速将动脉血以0.5 mL/s的速度注入兔枕大池内，一般首次造模型时以1.5mL/kg的量注入动脉血，二次造模时以1 mL/kg的量注入。注血后迅速拔针，用纱布按压局部1 min，并观察周围肌肉间隙内无渗血后将青霉素粉末撒在伤口局部，分层缝合肌肉和皮肤。⑤术毕将其按头低30°位放置以利于血液分布在基底动脉周围。48 h后以同样方法进行第二次造模。盐水组动物模型的具体方法同SAH造模组，只是注入等量的37 ℃生理盐水以替代自体血。穿刺组仅分离枕部组织并行枕大池穿刺，穿刺要求见到脑脊液流出，48 h后进行第二次穿刺。正常对照组未进行任何手术操作。

　　1.4 标本取材

　　所有白兔饲养到对应时间后，用250 g/L乌拉坦以3 mL/kg麻醉，打开胸腔，剥开心包膜，暴露心脏，将下腔静脉和腹主动脉用动脉夹夹闭，剪开右心耳放出血液，再剪开左心室将灌注头插入主动脉用动脉夹固定，先输入9 g/L生理盐水将血管内的血冲洗干净，再注入40 g/L的多聚甲醛液2 000 mL灌注固定。

　　1.5 组织标本制备与免疫组织化学检测

　　将基底动脉标本经100 mL/L福尔马林固定，常规石蜡包埋，将标本在组织切片机上制作成5 μm切片，应用SABC法进行免疫组织化学染色，在光镜下进行观察。

　　1.6 基底动脉周长的测定

　　所有标本在图像采集与分析系统(德国Leica公司Q550W型)中采集结果，并使用相关软件测定基底动脉的周长，收集数据。

　　1.7 统计分析方法

　　所有实验数据均用均数±标准差(x±s)表示，运用SPSS for Windows13.0计算机统计软件进行方差分析(ANOVA)和t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SAH后动物表现与标本大体观察

　　SAH组动物在造模后饮水、摄食、睡眠及体重方面均与对照组动物有显著差别。经40 g/L多聚甲醛灌注取脑后观察：SAH模型组在1 h可见广泛的SAH;3 d组、5 d组、7 d组可见枕大池、基底池附近及基底动脉周围明显的凝血块，随时间的推移，凝血块的范围、大小和颜色呈现减退，至10 d组凝血块已经基本消失，但仍可见少量SAH和蛛网膜黄染表现。

　　2.2 光镜下HE染色

　　穿刺对照组、盐水对照组的血管结构与正常组一样，基底动脉血管壁无增厚，内膜由内皮细胞组成，内皮细胞结构完整，中膜主要是平滑肌细胞及其周围的细胞外基质，外膜主要由成纤维细胞和疏松的结缔组织构成。SAH模型组可见基底动脉血管壁增厚，管腔狭窄，内皮细胞变形、肿胀，染色质不均，空泡形成;内弹力膜迂曲皱褶或断裂，厚薄不均;中膜增厚，平滑肌细胞排列紊乱;外膜可见淋巴细胞或单核细胞浸润。

　　2.3 CGRP在基底动脉血管内皮细胞上的表达

　　在穿刺对照组、盐水对照组CGRP在基底动脉内皮的表达与正常组相同(图1A);SAH模型组CGRP的表达在1 h时最明显，在3、5 d依次表达减少，5 d达到最低点，表达最弱(图1B-1C)，7 d后开始逐渐升高，10 d时表达相对比较明显，但未能达到正常水平(图1D)。

　　2.4 ETRA在基底动脉血管

　　内皮细胞上的表达 在穿刺对照组、盐水对照组ETRA在基底动脉内皮上的表达与正常组相同(图2A);SAH模型ETRA主要表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞，ETRA在各时间段都有表达，但在3 d时染色最重(图2B)，5 d时染色稍淡(图2C)，10 d时表达相对比较淡，但未能达到正常水平(图2D)。盐水组脑血管ETRA表达情况各时间段免疫染色强度没有太大的区别。正常组脑血管ETRA的表达染色浓度很淡。

　　2.5 基底动脉周长的变化

　　SAH模型组基底动脉周长在第5天时缩小最强，此后会慢慢恢复，但到第10天仍恢复不到正常状态。SAH实验组与盐水对照组血管周长在各时间之间比较，二者有显著性差异(P<0.05);但盐水组与正常组比较，二者没有显著性差异(P>0.05);对盐水组、穿刺组与正常组的血管周长的数据进行组间方差分析，结果无显著性差异(P>0.05，表1)。表1 各组基底动脉周长的测定结果(略)

　　3 讨论

　　CGRP是由37个氨基酸组成的多肽，广泛存在于支配脑血管的神经末梢中，属于一种内源性舒血管神经肽。目前认为，CGRP的舒张血管机制可能是[6-8]：①CGRP对血管的直接作用;②通过激活血管平滑肌细胞上K+-ATP通道来实现;③细胞内第二信使cAMP介导作用，cAMP升高程度与血管扩张反应强弱密切相关;④CGRP能维持细胞内Ca2+稳定，降低细胞膜Ca2+通透性。有研究认为，CGRP的舒张血管作用依赖于内皮起源的一氧化氮，并与cGMP调节抑制和平滑肌细胞内cAMP聚积有关;⑤CGRP产生的扩血管作用可被内皮损伤和干扰内皮起源舒张因子(EDRFAch)调节反应的药物所阻断;CGRP也可以不通过EDRFAch的作用或通过活化平滑肌细胞上的特殊受体而促使平滑肌细胞内cAMP水平升高及钙离子浓度下降，依次导致钙调蛋白形成、肌球蛋白轻链激酶和肌动蛋白的ATP酶激活障碍，产生非内皮依赖性血管扩张效应。

　　ET-1是由21个氨基酸残基组成的多肽，自从1988年Yanagisawa等[9]从培养的猪内皮细胞上清液中分离出该物质后，通过实验研究人们发现ET-1的缩血管作用是和ETRA特异性的结合后才发挥出来的。现已研究证明[10-11]：ET-1和ET-2对豚鼠大脑中动脉产生强烈的浓度依赖性收缩。这些发现显示了大脑血管存在ET-A受体，而且ET-1产生这种明显的脑血管收缩主要是激活ETRA。Nilsson等[12]用Bosentan(Ro47-0203，非肽类的ETRA和ETRB拮抗剂)、FR139317(选择性的ETRA拮抗剂)和Sarafotoxin 6c(选择性的ETRB激动剂)三种药物进行实验研究，测定了血管对ET-1在用受体阻断剂和不用受体阻断剂的情况下的反应，结果发现ET-1可以诱发人大脑动脉浓度依赖性收缩，血管收缩可明显被ETRA拮抗剂(Bosentan和FR139317)拮抗。此外，在有和没有内皮的人大脑动脉都可以探查到编码ETRA和ETRB的mRNA，亦提示ET-1诱发人大脑动脉收缩主要由ETRA调节。

　　由于CGRP是体内最强的舒血管物质，而ET却是迄今为止发现的最强的血管收缩物质[2,13]。从本实验结果可以看出：①SAH模型组在第5天其基底池和基底动脉周围的凝血块最为明显，在10 d时已经仅可见广泛的SAH，凝血块已基本吸收。②对各组基底动脉的周长进行t检验后可以发现：SAH模型组第5天的周长最小，且从1 h至7 d呈进行性下降趋势，在第5天达到最低点，这个变化过程提示SAH后在3 d至7 d是CVS发生最严重的时期，这个变化与赵振伟等[14]的研究结果相同。③在SAH模型组，CGRP在基底动脉内皮细胞上的表达呈现规律性变化：从1 h开始到7 d，CGRP的表达呈降低趋势，在第5天达到最低点，从第7天开始缓慢上升，到第10天时表达已明显，但未能达到正常水平。CGRP的这种降低趋势可导致基底动脉持续性缩窄，在实验过程中，当CGRP在血管内皮细胞上表达呈现最低趋势的时候，所测得的基底动脉的直径最小，也就是说发生了显著的DCVS。④在本实验中，正常组、穿刺组和盐水组的基底动脉内ETRA均有少量表达;但SAH组基底动脉内ETRA却呈现强表达，其免疫组化染色在第3天最强烈，成深棕色的染色，这种表现以血管内皮细胞表达最强烈，平滑肌和外膜也有表达，到第10天时ETRA的表达强度仍然较重。

　　综上所述：正常脑血管上本身就有CGRP和ETRA的表达，二者的平衡可能起到了维持血管正常生理功能的作用，在病理状态下，当二者的平衡被打破后就导致脑血管痉挛的发生。本实验初步结果表明：①SAH后脑血管内皮细胞CGRP和ETRA的表达呈现明显的动态改变，CGRP的表达在第5天达到最低点，而ETRA的表达却是在第3天时最强烈;②由于CGRP和ETRA在脑血管表达的变化趋势并不同步消长，说明SAH后CVS的发生机制非常复杂，很可能是多种因素共同作用的结果，但CGRP和ETRA在DCVS的发生发展中起重要的作用。

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