兔蛛网膜下腔出血后脑脊液和血清S100B的变化及其意义

　　作者：陈钟樑，宋锦宁，王文博，隋龙 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院神经外科，陕西西安 710061

　　【摘要】目的 探讨兔蛛网膜下腔出血(SAH)后血清和脑脊液(CSF)中S100B蛋白的变化及其意义。方法 采用枕大池二次注血法制作SAH模型，动物随机分为正常组、穿刺组、盐水对照组和SAH组，正常组于饲养观察3d后取其血清及CSF，其余各组分别于建模后1h、3d、5d、7d、10d取血清及脑脊液。应用双抗体夹心ELISA法检测各组血清及CSF中S100B蛋白的浓度。数据结果应用统计软件SPSS13.0进行处理。结果 SAH组血清及CSF中S100B蛋白浓度在各个时间点均明显高于其余3组(P=0)，并呈现血清S100B蛋白浓度于SAH后1h即开始升高，3～5d达到高峰后逐渐恢复，而CSF中S100B则于SAH后1h升高后稍下降;再于5～7d第二次达到高峰的变化。盐水组则呈现血清和CSF中S100B蛋白于造模后1h高于穿刺组及正常组(P<0.05)，然后迅速下降至正常。结论 SAH后血清与CSF中S100B蛋白浓度呈明显的动态变化。测定血清与CSF中S100B蛋白浓度对判断SAH后血脑屏障(BBB)的病理生理改变具有重要意义。

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血 S100B蛋白 血脑屏障

　　Changes of the S100B protein concentration in serum and CSF after subarachnoid hemorrhage in rabbit model and their significance

　　CHEN Zhongliang, SONG Jinning, WANG Wenbo, SUI Long

　　Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061, China

　　ABSTRACT: Objective To discuss the changes of the S100B protein concentration in serum and cerebral spinal fluid (CSF) after subarachnoid hemorrhage (SAH) in rabbit model and their significance. Methods Rabbit SAH model was induced by the cisterna magna puncture and injection two times of autogeneic blood into the cisterna magna. The animals were divided randomly into SAH group, saline group, puncture group and blank group. The serum and CSF were taken in blank group after 3 days breeding. At 1h, 3d, 5d, 7d and 10d after the first infusion, the serum and CSF of the other groups were taken. ELISA method was used to detect S100B protein concentration in serum and CSF. The result data was analyzed by software SPSS13.0. Results S100B protein concentration in serum and CSF of SAH group was much higher than that in the other three groups (P=0). S100B protein concentration in serum ascended from 1h after SAH, reached the peak at 3～5d after SAH, and then descended slowly. S100B protein concentration in CSF ascended from 1h after SAH, then slightly descended, ascended and reached the peak at 5～7d after SAH, and then descended slowly. S100B protein concentration in serum and CSF of saline group was higher than that in puncture group and blank group from 1h after model establishment (P<0.05). S100B protein concentration of saline group recovered quickly. Conclusion S100B protein concentration in serum and CSF after SAH has obvious changes. S100B protein concentration in serum and CSF after SAH is of great significance to judging pathophysiology of bloodbrain barrier.

　　KEY WORDS: subarachnoid hemorrhage; S100B protein; bloodbrain barrier

　　蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一种常见的出血性脑血管病[1]。该病常可导致颅内发生一系列病理生理改变，其中脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)继发的脑缺血是最常见的病理变化。另外，血脑屏障(bloodbrain barrier, BBB)的损害可引起血浆中很多有害物质进入脑组织，加重SAH后脑组织水肿，在SAH后的发病过程中亦起着重要的作用。但是，目前对BBB的研究主要是观察其结构的变化。本研究通过检测实验性兔SAH后血清和脑脊液(cerebral spinal fluid, CSF)中S100B蛋白浓度的变化，旨在探讨SAH后BBB的功能改变及其S100B蛋白在SAH后的变化规律及其意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验动物为雄性日本大耳白兔80只，健康状况良好，体重2.0～3.0kg，在相同的条件及环境中(饲料和温度均相同)饲养3d后进行实验。所有实验用兔均购自西安交通大学医学院实验动物中心。

　　实验试剂及药品：S100B蛋白ELISA试剂盒购自第四军医大学生理学教研室;40g/L多聚甲醛灌注液和250g/L乌拉坦溶液购自西安交通大学医学院器材科;利多卡因注射液及5.5号头皮针由西安交通大学医学院第一附属医院神经外科提供。

　　1.2 实验分组

　　动物随机分组，其中SAH模型组25只，盐水对照组25只，穿刺对照组25只，空白对照组5只。SAH模型组、盐水组和穿刺对照组根据建立模型后的不同时间段分为5个亚组，分别是：建模后的1h、3d、5d、7d、10d组。空白对照组取5只检测血清及CSF中S100B蛋白的正常浓度。

　　1.3 动物模型的建立

　　采用常规枕大池二次注血法制作SAH模型[2]。剪去头皮针外套管少许，自制固定穿刺深度为5～7mm的5.5号头皮针，兔枕部剃毛消毒后俯卧位，取穿刺针以与躯体成角30°于环枕间隙穿刺枕大池，穿刺深度自5mm开始，至轻负压回抽见清亮CSF流出为穿刺成功，取耳中动脉非抗凝血1.5mL/kg，0.5mL/s注入枕大池，头低位放置30min。首次注血后48h按注血量1mL/kg重复以上操作。

　　1.4 标本取材

　　所有大耳白兔饲养到预定时间后，自耳中动脉取动脉血5mL，置于离心机内3000r/min离心10min，取上清液，置于-70℃低温冰箱保存待测。头皮针穿刺枕大池取CSF 2mL，置于-70℃低温冰箱保存待测。然后用40g/L多聚甲醛灌流固定脑组织观察大体标本。用ELISA方法检测血清及CSF标本中S100B蛋白的浓度，步骤严格按照试剂盒说明进行。

　　1.5 统计学处理

　　数据以“均数±标准差”表示，用SPSS13.0软件包进行统计学处理。组间差异采用单因变量多因素方差分析、LCD检验，组内差异采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SAH模型组的大体观察

　　SAH组动物脑组织在1h可见广泛的SAH，3、5、7d可见枕大池、基底池附近及基底动脉周围明显血凝块，随时间推移，血凝块逐渐消退，到10d时，枕大池、基底池及基底动脉周围血凝块已基本消失，仅存少量SAH。

　　2.2 血清S100B蛋白浓度的变化

　　SAH组血清S100B蛋白浓度于造模后1h即开始升高，明显高于正常组、穿刺组、盐水组(P<0.05)，于3～5d达到高峰，自7d开始逐渐恢复，但仍高于正常，到10d时已基本恢复正常;盐水组血清S100B蛋白于造模后1h组即升高，明显高于正常组，但明显低于SAH组(P<0.05)，于3d开始逐渐下降，至5d以后与穿刺组、盐水组无明显区别。穿刺组在各个时间点与正常组之间的差异无统计学意义。各组血清S100B浓度测定结果见表1。表1 正常组、穿刺组、盐水组、SAH组血清S100B蛋白含量的变化(略)

　　2.3 CSF中S100B蛋白浓度的变化

　　SAH组CSF中S100B蛋白自1h开始升高，明显高于正常组、穿刺组、盐水组(P<0.05)，3d组稍微回落后再升高，于5～7d再次达到高峰后逐渐下降，到10d时仍明显高于盐水组、穿刺组和正常组(P<0.05)。而盐水组CSF中S100B的浓度于第二次枕大池注入生理盐水后即有明显的升高，与正常组、穿刺组相比具有统计学意义(P<0.05)，此后逐渐下降，到5d时基本恢复到正常水平。穿刺组与正常组在各个时间点分组上均无明显差异。各亚组CSF中S100B蛋白的浓度测定结果见表2。表2 正常组、穿刺组、盐水组、SAH组CSF中S100B蛋白含量的变化(略)

　　2.4 血清及CSF中S100B蛋白浓度变化的比较

　　分析比较血清及CSF中S100B蛋白浓度的变化，可以看出：①血清及CSF中S100B蛋白于SAH后均立即升高并明显高于盐水组和正常组;②血清S100B蛋白于SAH后3～5d达到高峰，CSF中S100B蛋白则在轻微下降后于SAH后5～7d达到高峰;③盐水对照组于造模后轻微升高后即逐渐下降。SAH后血清和CSF中S100B蛋白的动态变化见图1。

　　3 讨 论

　　S100B蛋白是近年来发展起来的一个中枢神经系统(central nervous system, CNS)特异性组织生化标志物。在人及哺乳动物，S100B蛋白特异性地表达于CNS神经胶质细胞中，因而被认为是脑特异性蛋白。正常情况下，S100B蛋白的表达水平受到精确的调控，当BBB结构完整、功能正常时，S100B蛋白不能通过BBB，故血中水平极低，而仅出现在CSF。只有在BBB受到损伤时，S100B才能通过受损的BBB进入血液，血中S100B蛋白明显升高[35]。故此，现在研究认为血清S100B蛋白可能是BBB开放的标志物，它是反映BBB损伤较为特异和敏感的指标[3]。

　　从本实验结果可以看出：①血清S100B蛋白在SAH后1h开始明显升高，于3～5d达到高峰，至10d恢复至正常。冯华等[6]在使用激光多普勒技术及电镜对大鼠SAH后局部脑血流量和BBB超微结构观察的研究中发现，大鼠BBB的损伤始于SAH后早期，于12～24h达到高峰，并持续较长的时间。谢宗义等[7]在使用伊文氏蓝和电镜观察大鼠SAH后BBB损伤时发现BBB的通透性改变在24～60h内发生，36h达到高峰。而GERMANO等[8]研究报道，BBB通透性在SAH后36h开始增加，于48h达最高峰，至72h恢复正常。虽然研究结果存在差异，但都表现出相同的变化趋势，即SAH后BBB的损伤始于急性期，且能自我修复。分析造成这种差异的原因，可能与实验采用的物种、动物模型的制作方法不一致有关。另外，结合本研究结果CSF中S100B蛋白浓度的变化，考虑当BBB损伤达到高峰后脑损伤进一步加重，CSF中S100B蛋白继续升高，从而使透过BBB进入血液的S100B蛋白显著增加，使血清S100B蛋白在时间上表现出轻度的延迟。故在SAH后早期或脑损伤较轻时，血清S100B蛋白可以敏感的反映BBB的开放，其浓度变化与BBB的开放程度呈正相关。而当SAH后脑损伤较严重时，血清S100B蛋白的浓度是BBB通透性增加和脑损伤致S100B蛋白释放增加共同作用的结果。②SAH后急性期BBB损伤的机制十分复杂。一般认为颅内压在SAH后所引起的脑灌注压的改变是短暂而有限的，故颅内压在SAH后BBB的损伤中所起作用有限[9]。但褚晓凡等[10]研究认为颅高压是SAH后BBB损伤的主要因素。本实验SAH组S100B蛋白明显高于其他3组，考虑在SAH后急性期BBB的损伤中，蛛网膜下腔的积血及其产物、以及颅高压均起着作用，且以蛛网膜下腔的积血及其产物刺激为主，而盐水组在造模后早期也出现S100B蛋白升高，可能与颅高压有关。

　　综上所述，SAH后血清与CSF中S100B蛋白浓度呈明显的动态变化，测定血清与CSF中S100B蛋白浓度对判断SAH后BBB的病理生理改变具有重要的意义。

　　【参考文献】

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　　[2]宋锦宁，梁琦，张明，等. 兔实验性蛛网膜下腔出血后脑血管超微结构的病理特征与动态变化 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2007, 28(4):388391.

　　[3]KAPURAL M, KRIZANACBENGEZ L, BARNETT G, et al. Serum S100beta as a possible marker of bloodbrain barrier disruption [J]. Brain Res, 2002, 940(12):102104.

　　[4]ROTHERMUNDT M, PETERS M, PREHN JH, et al. S100B in brain damage and neurodegeneration [J]. Microsc Res Tech, 2003, 60(6):614621.

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　　[6]冯华，王宪荣，章翔，等. 大鼠蛛网膜下腔出血后脑局部血流量与血脑屏障动态变化 [J]. 中华神经外科杂志, 2002, 18(4):242245.

　　[7]谢宗义，马颖，程远. 大鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性变化 [J]. 第三军医大学学报, 2007, 29(9):834836.

　　[8]GERMANO A, AVELLA D, IMPERATORE C, et al. Timecourse of blood brain barrier permeability changes after experimental subarachnoid hemorrhage [J]. Acta Neurochir(wien), 2000, 142(5):575580.

　　[9]JACKOWSKI A, CROCKARD A, BUMSTOCK G, et al. The time course of intracranial pathophysiological changes following experimental subarachnoid hemorrhage in the rat [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1990, 10(6):835849.

　　[10]褚晓凡，林世和，刘多三，等. 实验性蛛网膜下腔出血血脑屏障损伤探讨 [J]. 中华神经外科杂志, 1995, 11(1):54.