体外培养原代神经元损伤模型的建立及损伤后脑红蛋白的表达

作者：刘开东,周定标,尚爱加

作者单位：中国人民解放军总医院神经外科， 北京 100853

   【摘要】  目的 建立原代神经元机械性损伤的体外细胞模型并探讨神经元损伤后脑红蛋白 （NGB） 的表达变化。 方法 取出生12 h内Wistar鼠的大脑皮质，培养10~12 d后，采用所设计的标准模板，直视下进行损伤，采用免疫组化方法和图像分析技术观测损伤前、后不同时间点神经元的NGB免疫组化反应及其阳性信号的灰度值。 结果 皮质神经元损伤2 h后，NGB阳性信号强度即开始增加，16 h后达高峰，随后逐渐下降，128 h后恢复至损伤前水平。 结论 皮质神经元体外损伤模型可用于在体外观察神经元受到机械性损伤后细胞内蛋白表达变化的一些分子事件，简单实用。机械性损伤可以诱导神经元NGB在损伤后一定时间段内表达上调。

【关键词】  颅脑损伤； 脑红蛋白； 神经元

    Establishment of a mechanical injury model of primary cultured neurons in vitro

    and expression of neuroglobin after injury

    LIU Kaidong, ZHOU Dingbiao, SHANG Aijia, et al.

    Department of Neurosurgery, PLA General Hospital, Beijing 100853, China

    Abstract：  Objective  To establish a mechanical injury model of primary cultured cerebral neurons in vitro, and explore the expression of neuroglobin in the injured neuron.  Methods  Brain of Wistar rat (within 12 h post birth) was taken and the neurons were cultured for 10-12 days, then injury was made on a self-made standard template under direct vision. The immunohistochemical response of neuroglobin in the neurons and gray values of immunoreactive products were studied by immunohistochemical method and image analysis before and after injury at different intervals.  Results  The expression of neuroglobin began to increase at 2 h after injury and reached its peak at 16 h, then decreased gradually and recovered to the level before injury at 128 h.  Conclusion  This model is easy and reliable for mechanical injury of cultured neurons in vitro from brain and suitable for observing molecular events such as expression changes of a certain protein. And mechanical injury can induce the expression up-regulation of NGB in neuron injury in a certain time.

    Key words:  craniocerebral trauma;  neuroglobin;  neurons

    目前常用的在体颅脑损伤模型难以准确反映颅脑各组分各自对损伤的应答。本实验模拟体外纯化培养皮质神经元，尝试建立一个皮质神经元体外损伤模型，并希望通过观察体外神经元机械性损伤模型中脑红蛋白 （neuroglobin，NGB） 的表达变化，以更好地认识颅脑外伤后神经元内特异性蛋白表达水平的变化。

    1    材料与方法

    1.1    皮质神经元的培养    根据Banker等[1]的方法及本实验室培养神经元的经验加以改良如下：无菌分离出生12 h内的Wistar鼠 （军事医学科学院动物中心提供） 的大脑皮质，剥离软脑膜，用0.25%胰蛋白酶于37 ℃消化30 min，以含血清的种植液终止消化，制备成细胞数为5 × 105/ml的细胞悬液，将细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸 （Sigma） 的直径为35 mm的培养皿中 （Nunc)。培养液为含有10%胎牛血清 （Hyclone） 和10%马血清 （北京元圣马生物技术研究所） 及2 mmol/L谷氨酰胺、1%青霉素链霉素的DMEM （Gibco）。将细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，24 h后换全液 （培养液中不含胎牛血清）；3～4 d换半液并加入5 mg/L的阿糖胞苷 （Upjohn），以除去神经胶质细胞和其他能够进行有丝分裂的细胞。48 h后换半液，以后每3 d换半液1次，培养10～12 d待细胞成熟后进行损伤实验[2]。

1.2    损伤方法与分组    采用预先设计好的一个标准模板，其上划有纵、横平行线 （间距均为4 mm）；将其放置于含有已培养12 d的皮质神经元的35 mm培养皿的底部，并于直视下用锋利的无菌刀片严格沿着模板的线条均匀用力地制成纵、横的损伤路径。分为正常对照及损伤后0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、32 h、64 h、128 h，共10组，每组5皿。均用0.01 mol/L的PBS快速洗涤1次，再用4%多聚甲醛溶液固定30 min。

    1.3    免疫组织化学染色    采用链霉素抗生物素-过氧化物酶连接法 （SP法），其操作步骤参照免疫组化染色试剂盒SP-9000 （ZYMED） 说明进行。阴性对照用PBS代替一抗。其中小鼠单克隆抗大鼠NGB抗体由军事医学科学院放射与辐射医学研究所第13研究室制备。

    1.4    免疫组化阳性结果的图像分析    NGB免疫组化阳性反应为细胞质出现棕黄色颗粒。利用Image J图像分析软件 （NIH），测定不同时间点NGB免疫阳性信号灰度值 （取5个视野，放大倍数200 ×）。

    1.5    统计分析    统计学处理采用SPSS 11.0软件的单因素方差分析和t检验。先应用One-Way ANOVA进行总体差异分析；若有差异，再用t检验进行组间两两比较。

    2    结    果

    2.1    神经元纯化程度和成熟神经元的形态    培养10～12 d时，生长状态良好的神经元在相差显微镜下显得胞体饱满、有立体感，周边光滑、有亮晕，胞核界限清楚，核仁清晰可见，突起交织成网。培养3～4 d时，加入阿糖胞苷后48 h，可获得较纯化的神经元。对神经元进行计数显示，神经元以外的其他各种细胞 （包括星形细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞等） 在细胞总数中仅约占2% （图1）。

    2.2    损伤后神经元的改变    培养成熟的皮质神经元损伤后，在损伤处立即可见神经元的突起被完全切断并向后退缩。损伤1 h后，位于伤道边缘两侧的少量神经元开始出现崩解，8 h后伤道两侧存活神经元的突起开始向损伤处生长，随着时间的延长，神经元的突起充分延伸并交织成网。

    2.3    免疫组织化学染色及其图像分析    皮质神经元NGB免疫组化阳性反应为棕黄色颗粒，位于神经元的细胞质中。与正常对照组比较，NGB免疫阳性信号在损伤后色度加深，而其灰度值在损伤后2 h降低 （P ＜0.05），伤后4 h信号灰度值显著降低 （P ＜0.01），伤后16 h降至最低，此后阳性信号灰度值逐渐升高，伤后64 h仍低于正常水平，128 h恢复至正常水平 （表1，图2）。

    3    讨    论

    为了研究颅脑损伤后神经元在分子水平的病理变化，需要一种能再现颅脑损伤的实验模型。目前常用的在体损伤模型，虽然能够很好地反映颅脑损伤后的病理生理变化，但由于在体情况下各种因素的相互影响和制约，难以客观准确地反映颅脑各组分各自对损伤的应答，因此有必要对颅脑各种组分分别进行研究。为了探讨皮质神经元损伤与修复的机制，可以通过体外纯化培养皮质神经元建立一种可重复的皮质神经元体外损伤模型。目前国外已有学者进行了多方面的尝试，例如利用激光离断单细胞突起的模型[3]，利用旋转针头机械性造成划痕的损伤模型[4]，利用自由落体或液压损伤神经元模型[5-6]、加速损伤神经元模型[7]、牵位变形损伤模型[8]等。但实验设计复杂、系统造价昂贵。国内也有学者使用了与我们相同的致伤方法[9]，但遗憾的是，他们没能建立神经元损伤模型的控制标准，损伤程度的一致性无法控制；另外，其所显示的神经元也不是正常、成熟的神经元，难以反映损伤后神经元的变化。

本实验所建立的模型，采用了自行设计的损伤模板，简单、实用，使损伤程度的一致性得到了很好的控制，保证了模型的可重复性。另外，皮质神经细胞的种类很复杂，除神经元外还有原浆型及纤维型星形胶质细胞及少突胶质细胞等，各种细胞混杂在一起，必然会干扰观察结果。本实验采用阿糖胞苷抑制非神经元细胞生长，光镜下证实神经元纯度＞90%，保证了所用模型为体外培养的纯化神经元。

    NGB是21世纪初发现的球蛋白家族新成员，其高氧结合力及在神经元胞浆中高表达的特性，为神经元损伤与修复机制的研究开辟了一片新的领域[10]。目前已有实验证实，无论是体外神经元缺氧模型还是动物活体缺氧模型，神经元中NGB的表达在一定时间段内均上调；如果人为抑制或增加NGB的表达，则神经元或脑皮质的损伤即相应地加剧或减弱[11-12]。因NGB是携氧球蛋白，所以缺氧可诱导其表达上调，在缺氧时NGB可通过释放氧或其他分子机制保护神经元。关于机械性损伤能否引起神经元NGB表达发生变化，目前国内有实验采用自由落体致弥漫性脑损伤的活体模型进行研究[13]；结果显示：NGB mRNA在伤后的一定时间段内升高，提示机械性损伤可能诱导神经元的NGB表达上调。但该研究仅对NGB进行了核酸水平的表达检测，而NGB功能基于其蛋白质结构，因而，核酸水平的表达增高能否带来翻译水平的蛋白表达上调，还有待进一步证实。另外，自由落体致弥漫性脑损伤后必然发生脑水肿和继发性的脑缺血、缺氧，那么该模型中NGB表达上调的直接诱因还是缺氧，机械性损伤本身有无诱导作用，还有待阐明。

    本实验采用对体外培养的原代神经元进行直接机械性损伤，完全排除了缺氧因素的干扰。实验结果显示：NGB免疫反应强度在伤后2 h增强，伤后16 h达到顶峰，伤后64 h仍高于正常水平，128 h恢复正常水平。实验证明了机械性损伤本身可引起神经元NGB在蛋白水平上的表达上调。其机制尚有待研究，我们推测可能是机械性损伤直接造成线粒体损害和Na+-K+-ATP酶失活，致使神经元能量代谢障碍，细胞膜稳定性被破坏，引发NGB代偿性表达上调，以增加神经元的供氧，维持细胞膜的稳定性。另外，NGB伤后8 h显著高于正常水平，而该时间段也是受伤神经元突起重新生长并联接成网的过程，提示NGB参加了机械性损伤后神经元的修复，但NGB对机械性损伤的神经元有无保护作用，仍有待证实。

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