星形细胞肿瘤血管内皮生长因子和蛋白酶激活受体-1的表达
发表时间：2010-05-10 浏览次数：524次
作者：刘永军， 安丽文， 赵宪林， 关一夫 作者单位：1.中国医科大学附属第四医院 神经外科， 辽宁 沈阳 110032; 2. 中国医科大学 生物化学与分子生物学教研室， 辽宁 沈阳 110001
【摘要】 目的： 探讨血管内皮生长因子(VEGF)和蛋白酶激活受体-1(PAR-1)的表达与星形细胞肿瘤病理分级的关系以及两者的相关性。方法： 用半定量RT-PCR方法检测50例星形细胞肿瘤和10例正常脑组织中VEGF和PAR-1的表达水平。结果： 在正常脑组织中VEGF和PAR-1的表达与星形细胞肿瘤比较差异有统计学意义;VEGF和PAR-1在星形细胞肿瘤Ⅱ级、Ⅲ级与Ⅳ级中的表达水平，差别具有统计学意义。经Spearman等级相关分析VEGF和PAR-1两者的表达指数正相关(r=0.355，P<0.05)。结论： VEGF和PAR-1的表达与星形细胞肿瘤的侵袭性密切相关，可作为临床判断胶质瘤恶性程度、侵袭性的重要指标。
【关键词】 星形细胞瘤; 逆转录聚合酶链反应; 血管内皮生长因子; 蛋白酶激活受体-1
Expression of VEGF and PAR-1 in Astrocytoma
LIU Yongjun1, AN Liwen2, ZHAO Xianlin1, GUAN Yifu2
(1.Department of Neurosurgery, The No. 4 Affiliated Hospital of Medical University of China, Shenyang 110032,
Liaoning, China; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, School for Basic Medicine,
Medical University of China, Shenyang 110001, Liaoning, China)
[Abstract] Objective: To investigate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and protease-activated receptor 1(PAR-1) in astrocytoma and their correlation. Methods: Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction was performed to detect the expression of VEGF and PAR-1 in 50 cases of astrocytic tissues and 10 cases of normal brain tissues. Results: The expression indexes of VEGF and PAR-1 between the astrocytic tissues and the normal brain tissues were of statistical difference. Significant differences in the expression indexes of VEGF and PAR-1 were found among the tumor tissues of grade Ⅱ, grade Ⅲ and grade Ⅳ. There existed significant positive correlation between the expression indexes of VEGF and PAR-1 (r=0.355, P<0.05). Conclusions: The expression of VEGF and PAR-1 are closely correlated with the development of the invasive activity of human astrocytoma, which may be helpful in judging the malignancy and invasion of astrocytoma.
[Key words] astrocytoma; reverse transcriptase polymerase chain reaction; vascular endothelial growth factor; protease-activated receptor 1
星形细胞肿瘤是最常见的脑胶质瘤之一，约占全部脑胶质瘤的17%～39.1%。由于其侵袭性生长方式，导致手术难以完全切除肿瘤组织，5年生存率为14%～31%[1]。因此，从分子肿瘤学角度研究瘤侵袭性的发生、发展机制，探讨有效治疗措施十分必要。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和蛋白酶激活受体-1(protease-activated receptor 1，PAR-1)与肿瘤的发生、发展的关系受到广泛的重视。采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)方法对50例星形细胞肿瘤组织和10例正常脑组织VEGF mRNA和PAR-1 mRNA表达水平进行检测并行半定量比较，对两者相关性进行分析，旨在探讨VEGF和PAR-1与星形细胞肿瘤侵袭性的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
50例不同级别星形细胞肿瘤选自中国医科大学附属第四医院神经外科。按1993年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准分类：星形细胞瘤(WHO Ⅱ级)15例，间变性恶性星形细胞瘤(WHO Ⅲ级)19例，多形性胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)16例。其中，男35例，女15例，年龄24～70岁(中位年龄49岁)。所有病例术前均未行化疗、放疗和其他抗癌治疗。取在脑外伤手术内减压中切除的脑组织10例作为正常对照。在手术间切下标本后马上投入液氮中冷冻30 min后转入-80℃冰箱中保存。Trizol试剂购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒(RNA PCR Kit AMV Ver.3.0)、引物均由TaKaRa公司提供。
1.2 方法
1.2.1 提取组织总RNA 采用Trizol一步法提取组织总RNA，用紫外分光光度仪检测其纯度，电泳检测其完整性，并将RNA稀释至500 mg/L。
1.2.2 半定量RT-PCR 反应体系依照试剂盒说明，反转录得cDNA后行PCR扩增，检测标本VEGF和PAR-1 mRNA表达水平。PCR反应选择处于指数生长期的循环数为反应条件，以确保PCR产物量能够反映最初的模板量;引物以Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)进行设计，并行生物信息学比对分析;以无菌双蒸水为阴性对照，以GAPDH为内对照，以试剂盒提供的对照RNA样品及其特异性引物的扩增产物为阳性对照。引物序列、扩增产物大小及PCR反应条件见表1。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，10 mg/L EB染色，凝胶成像系统(美国 Alpha FluorChem)成像，Image J软件分析灰度值，计算条带的积分吸光度(积分吸光度=平均吸光度×面积)。结果判定：以同一模板VEGF或PAR-1与GAPDH基因产物积分吸光度的比值作为VEGF或PAR-1的表达指数。
1.3 统计学处理
表1 引物序列、扩增产物大小及PCR反应条件所得数据计量资料用x±s表示，比较用t检验;相关性用Spearman等级相关分析。所有统计均在SPSS10.0统计软件包中完成，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF在正常脑组织和不同级别星形细胞肿瘤中的表达
见图1。在正常脑组织中VEGF的表达指数为0.37±0.04，与星形细胞肿瘤(0.47±0.07)比较差异有统计学意义(P<0.05);依照WHO中枢神经系统肿瘤分类，标准分类其Ⅱ级组(0.42±0.06)与Ⅲ级组(0.47±0.08)比较差异有统计学意义(P<0.05)，与Ⅳ级组(0.52±0.08)比较差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ级组(0.47±0.08)与Ⅳ级组(0.52±0.08)比较差异无统计学意义(P>0.05)。经Spearman等级相关证实，VEGF表达与病理分级成正相关(r=0.457，P<0.05)。注：1、3、5为星形细胞肿瘤;2、4、6为正常脑组织
2.2 PAR-1在正常脑组织和不同级别星形细胞肿瘤中的表达
见图1。在正常脑组织中PAR-1的表达指数为0.30±0.03，与星形细胞肿瘤(0.36±0.04)比较差异有统计学意义(P<0.05);依照WHO中枢神经系统肿瘤分类标准分类，其Ⅱ级组(0.33±0.04)与Ⅲ级组(0.36±0.04)比较差异有统计学意义(P<0.05)，与Ⅳ级组(0.38±0.06)比较差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ级组(0.36±0.04)与Ⅳ级组(0.38±0.06)比较差异无统计学意义(P>0.05)。经Spearman等级相关证实，PAR-1表达与病理分级成正相关(r=0.376，P<0.05)。
2.3 VEGF和PAR-1在不同级别星形细胞肿瘤表达的相关性
经Spearman等级相关分析表明两者之间存在显著相关性(r=0.355，P<0.05)。
3 讨论
肿瘤生长与血管生成有密切关系，实体肿瘤超过2 mm必须依靠新生的血管生成，才能与肿瘤宿主的脉管系统保持一定的连续性。在已发现的许多肿瘤血管形成因子中，VEGF是作用强、特异性高的血管生长因子之一，已在多种肿瘤细胞系和组织有相关报道[2]。VEGF以旁分泌方式作用于细胞上的2种受体flt-1和KDR，调控血管生成，为肿瘤提供充足的血液供应，促使肿瘤细胞恶性增殖和侵袭性生长[3]。应用RT-PCR方法对星形细胞肿瘤和正常脑组织中VEGF mRNA表达水平进行检测并行半定量比较，结果显示，在正常脑组织中VEGF的表达指数(0.37±0.04)与星形细胞肿瘤(0.47±0.07)比较差异有统计学意义(P<0.05);VEGF的表达指数随星形细胞肿瘤病理分级的增高而增高：Ⅱ级(0.42±0.06)，Ⅲ级(0.47±0.08)，Ⅳ级(0.52±0.08);其中Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级分别比较差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ级与Ⅳ级比较差异无统计学意义(P>0.05)。且经Spearman等级相关证实，VEGF表达与病理分级成正相关(r=0.457，P<0.05)。证实VEGF的表达与星形细胞肿瘤恶性程度密切相关，其研究结果与报道相似[4]。因此，VEGF可作为星形细胞肿瘤恶性程度的参考指标。
PAR-1是典型的7次跨膜G蛋白偶联受体，是第一个发现的凝血酶受体。PAR-1在血栓形成、炎症反应等过程中发挥多方面作用。新近PAR-1在肿瘤侵袭、转移中的作用日益受到关注[5]。Granovsky-Grisaru S等[6]利用原位杂交和免疫组织化学方法研究74例子宫内膜癌组织标本PAR-1 mRNA和蛋白表达水平发现，PAR-1的表达水平与病理分级相关，与组织类型无关，在正常、分化不良、低级别子宫内膜癌中表达阴性。Kaushal V等[7]利用实时定量RT-PCR和免疫印迹方法检测PAR-1表达水平，结果显示与早期前列腺癌组织相比，进展期前列腺癌中PAR-1 mRNA的表达增加2.39倍，蛋白水平增加2.75倍，且PAR-1的表达与术前PSA表达显著正相关，免疫组织化学结果PAR-1在肿瘤血管呈强阳性表达，提示PAR-1在肿瘤血管生成中可能有重要作用，有望成为诊断治疗的新靶点。应用RT-PCR方法对星形细胞肿瘤和正常脑组织中PAR-1 mRNA表达水平进行检测并行半定量比较，结果显示，在正常脑组织中PAR-1的表达指数(0.30±0.03)与星形细胞肿瘤(0.36±0.04)比较差异有统计学意义(P<0.05);PAR-1的表达指数随星形细胞肿瘤病理分级的增高而增高：Ⅱ级(0.33±0.04)，Ⅲ级(0.36±0.04)，Ⅳ级(0.38±0.06);其中Ⅱ级分别与Ⅲ、Ⅳ级比较差异有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ级与Ⅳ级比较差异无统计学意义(P>0.05)。且经Spearman等级相关证实，PAR-1表达与病理分级成正相关(r=0.376，P<0.05)。证实PAR-1的表达与星形细胞肿瘤恶性程度密切相关，其研究结果与子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤报道相似[6~8]。因此，PAR-1可作为判断星形细胞肿瘤进展的参考指标。
目前PAR-1与肿瘤血管生成的关系报道较少，且多局限于细胞系和动物模型实验。在前列腺癌细胞DU145中研究显示：用PAR-1的siRNA或ERK和PI3K的抑制剂均能减弱凝血酶诱导后VEGF和IL-8表达增加的作用，提示在前列腺癌细胞系中凝血酶PAR-1系统通过上调与肿瘤血管生成有关的细胞因子从而促进肿瘤进展[9]。Sarker KP等[10]在视网膜母细胞瘤NB-1细胞系中的研究显示，凝血酶和PAR-1的激动剂可增加VEGF的分泌，凝血酶抑制剂阿加曲班可有效减少该作用。通过对50例不同级别星形细胞肿瘤临床标本研究发现，经Spearman等级相关分析，VEGF和PAR-1两者的表达指数正相关(r=0.355，P<0.05)，提示两者在星形细胞瘤血管生成、肿瘤侵袭进展过程中具有协同作用，这为进一步探讨VEGF和PAR-1作用机制提供临床基础。
综上所述，VEGF和PAR-1的表达水平与星形胶质细胞瘤病理分级正相关，与侵袭性生物学行为密切相关，VEGF和PAR-1有可能成为反映星形细胞肿瘤恶性程度和病理分级的有效指标。
【参考文献】
[1] 吴承远，刘玉光. 临床神经外科学[M].北京: 人民卫生出版社, 2001: 249-254.
[2] Pradeep CR, Sunila ES, Kuttan G.Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors in tumor angiogenesis and malignancies [J]. Integr Cancer Ther,2005(4): 315-321.
[3] Roskoski R Jr. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression [J]. Crit Rev Oncol Hematol，2007(3): 179-213.
[4] Mentlein R, Forstreuter F, Mehdorn HM, et al. Functional significance of vascular endothelial growth factor receptor expression on human glioma cells [J]. J Neurooncol，2004(1-2): 9-18.
[5] Arora P, Ricks TK, Trejo J. Protease-activated receptor signalling, endocytic sorting and dysregulation in cancer [J]. J Cell Sci， 2001(6):921-928.
[6] Granovsky-Grisaru S, Zaidoun S, Grisaru D, et al. The pattern of protease activated receptor 1 (PAR1) expression in endometrial carcinoma [J]. Gynecol Oncol， 2006(3): 802-806.
[7] Kaushal V, Kohli M, Dennis RA, et al. Thrombin receptor expression is upregulated in prostate cancer [J]. Prostate，2006(3): 273-282.
[8] Massi D, Naldini A, Ardinghi C, et al. Expression of protease-activated receptors 1 and 2 in melanocytic nevi and malignant melanoma [J]. Hum Pathol，2005(6):676-685.
[9] Liu J, Schuff-Werner P, Steiner M. Thrombin/thrombin receptor (PAR-1)-mediated induction of IL-8 and VEGF expression in prostate cancer cells [J]. Biochem Biophys Res Commun，2006(1): 183-189.
[10] Sarker KP, Biswas KK, Yamaji K, et al. Inhibition of thrombin-induced vascular endothelial growth factor production in Human neuroblastoma (NB-1) cells by argatroban [J]. Pathophysiol Haemost Thromb，2005(1): 41-47.
