不同剂量胶原酶IV尾壳核内注射建立重度出血性脑卒中大鼠模型

　　作者：王振忠 作者单位：温州医学院第一附属医院 神经外科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的: 通过胶原酶IV尾壳核内注射，探索建立一种稳定的重度出血性脑卒中大鼠模型。方法: 45只SD大鼠随机分配到IV型胶原酶注射0.5 U组(A组，15只)、0.75 U组(B组，15只)及1.0 U组(C组，15只)。制作脑出血模型后24 h、72 h，对大鼠进行神经功能学评分，检测肢体功能缺损情况。通过多媒体病理图像分析仪测定脑血肿体积大小，并通过HE染色观察组织病理学变化。结果: 除A组1例外其余大鼠均形成明显血肿，C组形成血肿体积最大。3组大鼠均出现不同程度的神经功能缺损，以C组脑出血术后72 h最明显。但C组术后72 h病死率达73.33%，明显高于其他两组。24 h、72 h神经功能评分及血肿体积在A、B、C 3组间作两两比较差异均有显著性(P<0.01)。脑血肿区组织病理学观察表现为典型的脑出血改变。结论: 0.75 U IV型胶原酶尾壳核内注射可以诱导建立稳定的重度出血性脑卒中大鼠模型，该模型肢体功能缺损明显，存活率高，能作为促进出血性脑卒中大鼠神经功能恢复研究的可靠应用平台。

　　【关键词】 胶原酶类 脑血管意外 模型 动物

　　Establishment of severe intracerebral hemorrhage model induced by injection of collagenase type Ⅳ with different doses into caudate putamen nuelei in rats WANG Zhen-zhong，ZHUGE Qi-chuan. Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To establish a reliable and severe intracerebral hemorrhage model in rats by injection of collagenase type Ⅳ into caudate putamen nuclei. Methods: A total of 45 SD rats were randomly divided into group A， group B and group C. Animals in 3 groups received injection of collagenase 0.5 U，0.75 U and 1.0 U，respectively. The neurological behavior scores of rats were assessed at 24 h， 72 h after the injection. The volume of hematoma was detected by multimedia pathological imaging analysis system. Histopathological changes were observed with hematoxylin and eosin stain. Results: The experimental rats only except one in group A formed intracerebral hematoma，and group C showed the largest volume of hematoma. Rats in the three groups all showed neurological defect variously，and the most severe impairments was observed at 72 h after injection in group C. However，the mortality at 72 h after injection was 73.33% in group C，much higher than that in other groups. The scores of neurological behavior and volume of hematoma among group A，group B and group C showed obvious difference (P <0.01). Conclusion: A reliable and severe intracerebral hemorrhage model in rats can be induced by injection of 0.75 U collagenase type Ⅳ into caudate putamen nuclei. The model has obviously neurological deficit and a high persistence. This is an useful and reliable method to study intracerebral hemorrhage.

　　Key words: collagenases;intracerebral hemorrhage;animal models如何建立一种简单、快捷且重复性好又与人类脑出血接近的中重度脑出血模型是出血性脑血管疾病研究的一个重要课题。目前常用的实验性脑出血模型有以下4种：胶原酶诱导法、自体血注入法、微球囊充胀法和自发性脑出血。其中通过胶原酶诱导制作脑出血模型方法简单、快捷且重复性好，而且与人类脑出血病理、生化和病理生理学有许多相似之处[1]。为了建立一种重型脑出血的稳定模型，我们对0.5 U、0.75 U及1.0 U三种不同剂量IV型胶原酶尾壳核内注射建立的脑出血模型从形态学及神经功能学进行了研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂和仪器 IV型胶原酶125 U/mg(Sigma公司产品)，用生理盐水液配成浓度为0.25 U/μl的液体，常规4 ℃保存备用;立体定向仪(KOPE-975型，USA);电钻(NSK-NE22L型，Japan)。

　　1.2 实验动物分组 选用健康雄性SD大鼠45只，体重250～300 g，鼠龄5～7个月，由温州医学院实验动物中心提供[温动字：SYXK(浙2005-0061)];所有SD大鼠随机分为IV型胶原酶注射0.5 U组(A组，15只)、0.75 U组(B组，15只)及1.0 U组(C组，15只)。

　　1.3 脑出血模型制作 根据诸葛启钏等[2]译著“大鼠脑立体定位图谱”，运用立体定向仪向尾壳核注射IV型胶原酶来制作脑出血模型。术中大鼠肛温保持在36.5～37.5 ℃，手术后动物被送至通风和有空调的动物房每只单独饲养，术后24 h内自由饮水进食，室温保持在28 ℃左右。

　　1.4 神经功能学评分 ①按有无自发性向血肿同侧“划圈样”行走现象，从0级(无转圈)到3级(持续转圈)进行分级。②将大鼠的左侧后肢向外拉2～3 cm，观察其收缩情况，从0级(立即收缩到原位)到3级(在数秒后收缩到原位或无收缩)进行分级。③按通过2.4 cm×80 cm窄木条的能力，从0级(顺利通过)到3级(在木条上站立<10 s)进行分级。将3种检查的分级分数相加，即为该大鼠的运动功能评分(0～9分)，死亡大鼠记为10分。

　　1.5 脑血肿体积测定 术后72 h运动行为学检查后进行脑血肿体积测定(3组各15只)[3]，数码摄像后导入多媒体病理图像分析仪(MPIAS-500，武汉同济千屏影像工程公司生产)，按比例测算出血肿最大层面互为垂直的横径与纵径，然后根据多田公式(血肿体积=丌/6×血肿最大层面最长横径×纵径×血肿层数×层厚)，算出相应的血肿体积。

　　1.6 脑血肿区组织学观察 脑片经摄像后，取针道周边部分进行石蜡包埋、切片及HE染色后进行脑血肿区组织学观察。

　　1.7 统计学处理方法 所有数据经SPSS13.0软件包统计学处理，对各组数据进行正态性和方差齐性检验(用Levene检验法)，组内两两比较选择LSD-t或者Dunnett-t检验。

　　2 结果

　　2.1 神经功能学评分 C组术后24 h内死亡5只，24～72 h内死亡6只，神经功能评价均表现出明显同侧“划圈样”行走现象、左侧后肢收缩延迟及木条通过障碍。B组24～72 h内死亡1只，明显同侧“划圈样”行走现象，不同程度左侧后肢收缩延迟及木条通过延迟。A组未出现大鼠死亡现象，1只未出现同侧“划圈样”行走现象，其余表现为轻度同侧“划圈样”行走现象、左侧后肢收缩延迟或者木条通过延迟。见表1。

　　2.2 脑血肿体积大小测定 术后出现死亡的大鼠立即取脑组织进行脑血肿体积测定，只有A组1只大鼠未见明显血肿形成，其余均出现明显血肿。以C组总体血肿体积最大，部分死亡大鼠见几乎半侧脑组织均为血肿，B组血肿形成大小较均一，边界清楚，A组血肿较弥散，见图1。脑血肿体积测定结果见表2。

　　2.3 脑血肿区组织病理学观察 在光学显微镜下观察大鼠脑组织经切片HE染色后的组织学变化，可见血肿中央区有大量红细胞，血肿灶周边有一狭窄而不太规则的水肿带，出血区细胞几乎全部坏死，血肿周边神经细胞明显减少，排列紊乱，细胞存在空泡样变性、坏死，有较多的白细胞和小胶质细胞浸润，部分神经细胞核呈缺血性改变，核皱缩呈三角形(见图2)。

　　3 讨论

　　自从1990年Rosenberg等[4]创造性地建立了胶原酶诱导脑出血模型，胶原酶诱导法目前已经成为常用的实验性脑出血模型制作方法，该方法简单、快捷且重复性好，与人类脑出血病理、生化和病理生理学有许多相似性。其中IV型和VII型胶原酶多被用于脑出血动物模型构建。Peeling等[5]以及张艳玲等[6]均用IV型胶原酶成功建立了稳定的脑出血动物模型。

　　我们通过尾壳核内注射三种不同剂量IV型胶原酶来获得脑出血动物模型，发现0.75 U及1.0 U剂量均能形成明显脑内血肿并表现出明显肢体功能缺陷，尤以1.0 U为著，最大血肿体积达到135.95μl(相当于人102 ml的血肿，大鼠脑1μl出血相当于人0.75 ml出血[7])。但是1.0 U注射剂量常导致大鼠在72 h内死亡，本实验研究结果约为73.33%(15只模型，72 h内死亡11例)，与张化彪等[1]报道的当胶原酶用量达1 U时，大鼠几乎全部死于脑水肿和脑疝相似。而当用0.75 U时，能形成明显血肿，大小均匀，表现出明显左侧肢体功能障碍，72 h内死亡1例。而0.5 U组，1例未能形成明显血肿，部分未表现出明显的对侧肢体功能障碍。因此，通过0.75 U IV型胶原酶尾壳核内注射可以获得脑出血大鼠模型，经过神经功能学、大体解剖学和组织病理学评价，形成的血肿大小、形态和造成的功能障碍最符合重度脑出血的标准，且模型稳定，重复性强，大鼠存活率高，能够作为促进出血性脑卒中大鼠神经功能恢复研究的可靠应用平台。

　　Peeling等[8]研究表明血肿大小与胶原酶用量成正比。本实验中，单纯使用IV型胶原酶，表现为以渗血为主形成弥漫性血肿，虽然血肿大小均匀，但血肿形成时间长，与临床常见的急性脑出血的病理过程有一定区别。张艳玲等[6]研究表明，加用肝素能使血肿形成高峰提前，但也存在肝素干扰血肿的凝固和病理生理过程等缺点。我们将通过进一步研究，寻找更接近临床脑出血的动物模型。

　　【参考文献】

　　[1] 张化彪,张苏明.脑出血模型[J].国外医学:脑血管疾病分册, 2002,10(6):469-472.

　　[2] 诸葛启钏. 大鼠脑立体定位图谱[M]. 北京:人民卫生出版社,2005:75-80.

　　[3] 曹勇军,陈孝东,王引明,等.Ⅰ型胶原酶-肝素诱导的大鼠脑出血模型研究[J].中风与神经疾病杂志, 2006,23(4):466-468.

　　[4] Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke, 1990,21(5):801-807.

　　[5] Peeling J, Yan HJ, Corbett D, et al. Effect of FK-506 on inflammation and behavioral outcome following intracere-bral hemorrhage in rat[J]. Exp Neurol, 2001,167(2):341-347.

　　[6] 张艳玲, 陈康宁. 采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型[J]. 第三军医大学学报, 2002,24(12):1394-1395.

　　[7] Nath FP, Jenkins A, Mendelow AD, et al. Early hemody- namic changes in experimental intracerebral hemorrhage[J]. Neurosurg, 1986,65(5):697-703.

　　[8] Peeling J, Del Bigio MR, Corbett D, et al. Efficacy of diso-dium 4-[(tert-butylimino)methyl]benzene-1,3-disulfonate N-oxide (NXY-059), a free radical trapping agent, in a rat model of hemorrhagic stroke[J]. Neuropharmacology, 2001,40(3):433-439.