嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓损伤后水通道蛋白-4的影响

　　作者：彭忠勇, 陈志斌　修波, 敖 强　 蔡美华, 苏庆杰 王 埮, 赵振强 作者单位：(1.贵阳市第二人民医院 神经内二科， 贵州 贵阳 550022; 2.海南医学院， 海南 海口 570102; 3.清华大学第二附属医院 神经外科， 北京 100039)

　　【摘要】 目的： 探索大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury SCI)后水通道蛋白4(AQP4)和后肢功能的影响。方法: 取Wistar大鼠150只，随机分为正常组(50只)、模型组(50只)、OECs移植组(50只)，模型组和OECs移植组用改良的Allen法制成脊髓损伤模型，造模成功后，其中OECs移植组在损伤处移植嗅鞘细胞，模型组移植DF12培养液。于术后1、3、7、14、21、28 d进行BBB (BassoBeattleBresnahan)运动功能评分，应用免疫组织化学技术检测脊髓组织AQP4的表达，并用图像分析仪进行定量分析。结果: 术后3～28 d，OECs移植组的BBB评分较模型对照组明显提高, 术后第1天，模型组和OECs移植组受损脊髓灰质、白质中AQP4的表达明显增加;第3天时均达到高峰，但OECs移植组低于模型组(P<0.05)。第7、14、21、28天，与模型组比较，OECs移植组AQP4表达也较低(P<0.01)。结论: OECs移植使脊髓损伤后AQP4表达减少，这可能有利于抑制脊髓水肿、消除脊髓继发性损伤，保存残存正常脊髓组织并促进神经轴突再生，改善其肢体运动功能。

　　【关键词】 脊髓损伤; 细胞移植; 大鼠，Wistar; 嗅鞘细胞; BBB评分; 水通道蛋白4

　　Effect of Olfactory Sheath Cell Transplantation on Water Channel

　　Aquaporin4 in Rats with Experimentally Injured Spinal Cord

　　PENG Zhongyong1, CHEN Zhibin2, XIU Bo3, AO Qiang3, CAI Meihua2, SU Qingjie2， WANG Tan2, ZHAO Zhenqiang2

　　(1.The Second Department of Neurology the Second People's Hospital of Guiyang, Guiyang 550022, Guizhou, China;

　　2. Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan, China; 3. Department of Neurosurgery,

　　The Second Affiliated Hospital of Tsinghua University, Beijing 100039, China)

　　[Abstract] Objective: To investigate effects of transplanted olfactory sheath cells (OSC) on the water channel aquaporin4 (AQP4) expression and function recovery of hind limbs in rats with experimentally injured spinal cord. Methods: One hundred and fifty Wistar rats were randomly divided into normal group (group N), model group (group M) and OSC transplantation group (group OSC), with 50 rats in each. Modified Allen method was used to establish spinal cord injury model in groups M and OSC. OSCs were transplanted into the transected site of spinal cord in group OSC, while DF12 solution was given into that of group M after the spinal cord injury model was made successfully. On the 1st, 3rd, 7th, 14th, 21st, and 28th days after the injury, the hind limb function of rats were estimated with system of BBB locomotion score, and the AQP4 expression in spinal cord tissue was determined by immunohistochemistry technique and quantity analyzed with image analyzer.Results: From day 3 to day 28, the BBB locomotion scores of group OSC was higher than those of group M (P<0.05). AQP4 expression in gray matter and white matter of spinal cord was significantly increased in groups M and OSC on day 1 after the injury, and reached the peaks on day 3. The peak value of group OSC was significantly lower than that of group M (P<0.05), and so were other values on days 7, 14, 21, and 28 (P<0.01).Conclusions: AQP4 expression decreases after the transplantation of OSCs in injured spinal cord which might benefit the inhibition to spinal cord edema and alleviation of secondary lesion. In this way OSC transplantation can protect the remained normal spinal cord tissues, promote the regeneration of axons, and enhance the recovery of locomotion function.

　　[Key words] spinal cord injuries; cell transplantation; rats, wister; olfactory sheath cells; BBB locomotion score; water channel aquaporin4

　　水通道蛋白4(Aquaporin4，AQP4)又称为汞不敏感水通道蛋白(mercury insensitive water channel，MIWC)，主要分布在中枢神经系统包括脑和脊髓[1]。在对鸡胚胎的脑AQP4表达的研究中发现，AQP4的表达与中枢神经系统的血-脑(脊髓)屏障的成熟和功能相关[2]。已经有很多实验表明通过抑制脊髓损伤后AQP4的表达有利于消除脊髓水肿的形成，减轻脊髓继发性损伤，促进脊髓神经功能的恢复。通过观察嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植对脊髓损伤条件下AQP4表达的影响，以期能有助于解释脊髓继发性损伤中细胞分子水平的病理机制，为保护残存的脊髓神经组织拓展新的思路，同时能更进一步为OECs移植治疗脊髓损伤提供理论支持。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　DMEMF12 (DF12 )培养基购自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自 Gibico公司;多聚赖氨酸(PLL)、 阿糖胞苷(Arac)、Mayer苏木素购自Sigma公司;Rabbit antiAquaporin4、SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物有限公司产品;成年Wistar大鼠150只，重200～250 g，由中国军事医学科学院实验动物中心提供。

　　1.2 移植细胞的制备

　　取Wistar雄性大鼠，常规碘伏消毒皮肤，取口腔入路切开双侧颊部达颈椎，断颈去掉下颌骨及额部皮肤肌肉，自皮下将头颅取下。将前颅打开，暴露嗅球，显微镜下将2个嗅球完整取下，立即放入冰的DMEM抗菌素液中(青霉素、链霉素各100 IU/ml)，并将嗅球被膜剥下，将嗅球组织在加抗生素的DMEM液中清洗3遍;将嗅球用眼科剪剪碎，加入0.25%的胰酶在37 ℃孵育箱中孵育20 min;离心除去悬浮液，换液体2次;加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum FBS)的DMEM液1～2 ml，终止消化;细胞液过100 μm细胞筛;离心去除上清液(800 r/min，10 min，室温)。用DMEM稀释细胞浓度至1×106/L，种植于无包被处理的细胞培养皿内，置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。按改良NASH差速贴壁法在培养18～20 h后，将悬液细胞液吸出，重新种植于包被多聚右旋赖氨酸的细胞培养皿内，加DF12(DMEM∶F12=1∶1)完全培养液3 ml进行培养。为了便于免疫组织化学显微镜下观察，可将多聚赖氨酸处理的盖玻片放入培养皿内，在盖玻片上进行细胞培养。差速贴壁后第2天，加入5 μmol/L Arac作用24 h，换液并用培养液冲洗3次。观察细胞生长情况，每2～3 d半量换液1次，培养14～18 d。经P75NGFR及胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色鉴定确定为OECs并测定细胞纯度为(90±6)%。在移植前用DMEMDF12培养液调整OECs 细胞浓度为 5×1010个/L[3，4]。

　　1.3 大鼠脊髓损伤模型的制作

　　用改良Allen方法。选用Wistar大鼠，雌雄各半，雌鼠无孕，体重200～250 g。2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，将动物俯卧，固定于自制大鼠手术台上，背部剪毛，常规消毒，以T12为中心，沿背部正中切开，切口长约2～3 cm，咬除T11～13棘突及全部椎板，暴露 T12脊髓，使硬脊膜完整，用重量10 g、直径4 mm的钢棒于10 cm的固定高度呈自由落体落下撞击脊髓，造成大鼠脊髓不完全性损伤的挫伤模型。造模成功的标志为大鼠双下肢呈回缩性扑动，尾巴出现痉挛性摆动。正常组不作处理。术后协助大鼠排尿、排便并予保温、防褥疮及抗感染等处理。

　　1.4 实验分组

　　将制成的150只脊髓损伤模型大鼠随机分为3组，每组50只。A组为正常组，不作处理;B组为模型对照组，于脊髓损伤处注射DMEMF12 (DF12 )培养液12 μl;C组为 OECs移植组，于脊髓损伤处注入OECs悬液12 μl。

　　1.5 细胞移植

　　造模后暴露脊髓，OECs移植组在脊髓损伤头尾两侧缘中线处注射细胞悬液，注射深度分别为1.75、1.25、0.75 mm，每点在约30 s内注射2 μl，注射针头在每点留置约1 min，共注射12 μl;模型对照组则按上法缓慢注入12 μl不含细胞的DMEMF12 (DF12 )培养液，注射完毕后逐层缝合。术后常规护理。

　　1.6 BBB (BassoBeattleBresnahan)运动功能评分

　　采取双盲法对模型对照组和OECs移植组大鼠进行评分，于术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d进行，共6次。

　　1.7 脊髓取材

　　模型组及电针组于术后1、3、7、14、21、28 d麻醉动物(每次每组取8只大鼠)，行开胸术暴露心脏，用12号灌注针头沿左心室插入主动脉，迅速剪破右心耳，同时用37 ℃生理盐水约200 ml经左心室主动脉灌注冲洗血液，至右心耳流出淡红色液体后，用4 ℃含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)250 ml快速灌注固定，于损伤中心向头尾各1 cm处切断脊髓，做连续石蜡切片，行免疫组织化学染色。

　　1.8 AQP4检测

　　脊髓组织经石蜡包埋，切片机将蜡块切成厚度约5 μm的石蜡切片，采用免疫组织化学染色检测AQP4的表达。

　　1.9 染色积分光密度(integrated optical density，IOD)检测

　　每只大鼠取12张切片，用病理图像分析系统(3.0)分析各片的IOD，12张切片均值为该大鼠脊髓的AQP4染色IOD。

　　1.10 统计学分析

　　用SPSS11.0 for windows版统计软件包处理，对实验数据进行两两配对t检验或单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 BBB运动功能评分

　　脊髓损伤术后第1天，所有大鼠后肢均不能活动;术后3 d，OECs移植组和模型对照组后肢运动功能均有轻微恢复;术后7 d，OECs移植组BBB运动功能评分均明显高于模型对照组，差异有显著性意义(P<0.05)，术后14～28 d，OECs移植组BBB评分提高更为显著(P<0.05)，与模型对照组之间BBB评分差值有增高趋势，提示OECs移植可促进SCI大鼠后肢运动功能恢复(表1)。表1 大鼠各阶段BBB运动功能评分结果

　　2.2 损伤脊髓AQP4的表达

　　2.2.1 各组大鼠免疫组织化学染色结果 正常组大鼠第1、3、7、14、21、28天的脊髓切片中在脊髓灰质和白质均可见一定量AQP4表达，阳性细胞胞膜呈黄褐色;阳性细胞主要位于神经胶质细胞胞膜及临近毛细血管的星形胶质细胞突起末端的脚板膜上(血脑屏障的重要组成部分之一)及白质髓鞘周围的神经胶质细胞(主要是少突胶质细胞)膜上，部分胶质界膜也有表达，而神经元膜上几乎无表达。

　　2.2.2 AQP4免疫组织化学IOD测定结果 见表2。术后第1天，OECs移植组和模型对照组大鼠脊髓灰质白质中可见神经胶质细胞膜上黄褐色免疫标记明显增加，与正常组比较差异有显著性(P<0.05);两组在第3天，AQP4表达均达最高值，且白质中AQP4表达强于灰质，少数神经元膜上也出现弱阳性，与正常组比较差异有显著性(P<0.01)，而OECs移植组表达又弱于模型对照组(P<0.05);术后第3、7、14、21、28天OECs移植组AQP4表达与模型对照组比较,进一步降低(P<0.05或P<0.01)，第28天时OECs移植组AQP4表达部分几乎已经接近正常。表2 各组大鼠术后不同时间AQP4免疫组织化学IOD比较

　　3 讨论

　　目前认为脊髓损伤后难以恢复的主要原因包括：(1)对脊髓的直接打击及继发损伤使脊髓内功能神经元大量坏死或凋亡，而神经元再生困难[5];(2)脊髓损伤后暴露的髓鞘相关抑制分子及继发的胶质瘢痕阻碍了轴突的生长和正确连接[6];(3)损伤造成局部细胞凋亡，致使细胞分泌的神经营养因子减少，破坏了支持轴突再生的有利微环境[7]。

　　水通道蛋白是近十年来发现的在水分子的跨膜流动方面起着关键性作用的一种细胞膜通道蛋白。分布于中枢神经系统的水通道蛋白主要为AQP4和AQP1，其中尤以AQP4分布最广泛。AQP4为6次跨膜的四异聚体蛋白，主要分布于脑室系统的室管膜、蛛网膜下腔及血管周围的星形胶质细胞以及渗透压感受区，这种分布特点是胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要结构基础。AQP4的发现为人们提供了从分子学水平上探讨脑和脊髓水肿发生发展新的靶点。Manley，GT等[8]于2000年报道了AQP4基因剔除大鼠在急性水中毒和大脑中动脉栓塞所致的局部缺血性卒中的条件下，脑组织的水含量和黏附在毛细血管周围的星形胶质细胞轴突肿胀会明显减轻，提示了拮抗AQP4这一中枢神经水液运输的关键物质可以成为减轻中枢神经系统组织水肿新的治疗手段。也为探索脑和脊髓损伤的病理机制及治疗研究拓展了新的思路。

　　嗅鞘细胞(OECs)兼具中枢和周围2个神经系统细胞特性，可表达和分泌多种细胞表面黏附分子及神经营养因子，对中枢神经元轴突再生有着其他类型细胞难以取代的作用，被认为是SCI细胞替代疗法中较理想的细胞来源之一[9，10]。

　　本实验观察到，OECs移植组在第3、7、14、21和28天大鼠BBB运动功能评分逐渐提高，与模型对照组比较有显著差异(P<0.05)，这与脊髓损伤后AQP4表达的减少是一致的。说明OECs移植通过使脊髓损伤后AQP4表达的减少，可能抑制脊髓水肿的程度来消除脊髓的继发性损伤，保护了残存的正常脊髓组织并促进其神经组织的重建。

　　脊髓损伤涉及到瞬间的原发损伤和继而在受损部位发生一种持续组织代谢障碍、水肿和血流量下降的继发损伤。此诸多因素导致了脊髓神经元受到损害和被广泛抑制，表现休克状态[11]。本研究结果显示OECs移植能明显地抑制脊髓损伤后AQP4的表达，促进脊髓功能的恢复。其机理可能为OECs移植能通过抑制脊髓损伤后AQP4的表达，减轻脊髓损伤部位水肿、血肿的压迫，减少脊髓继发性损伤的加重因素，从而创造能支持轴突再生的有利微环境。这可能是OECs移植促进脊髓损伤功能恢复的又一分子机制之一。

　　【参考文献】

　　[1]Hasegawa H, Ma T, Skach W, et al, Molecular cloning of a mercurial insensitive water channel expressed in selected watertransporting tissues[J].J Biol Chem, 1994(8)：5497-5500.

　　[2]Nico B, Frigeri A, Nicchia GP, et al. Role of aquaporin4 water channel in the development and integrity of the bloodbrain barrier[J]. Cell Sci, 2001(7)：1297-1307.

　　[3]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equiralent of wush injury of fracture dislocation of spinal cotum[J].JAMA,1911(10):878-880.

　　[4]Takami T,Oudega M.Bates ML.et al.Schuanncell but not olfactory ensheathing glia tomsplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord[J].J Newo sci,2002(15):6670-6681.

　　[5]Mc Gee AW, Stritt matter SM. The Nogo66 receptor: focusing myelin inhibition of axon regenetation [J]. Trends Neurosci, 2003(26):193-198.

　　[6]Ying Z , Roy RR , Edgerton VR, et al . Exercise restores levels of neurotrophins and synaptic plasticity following spinal cord injury [J].Exp Neurol,2005(2):411-419.

　　[7]Raisman G .Olfactory ensheathing cells and repir of brain and spinal cord injuries [J] , Cloning stem cells,2004(4):364-368 .

　　[8]Manley GT, Fujimura M, Ma T, et al. Aquaporin4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke[J]. Nat Med, 2000(2)：159-163.

　　[9]Richter MW, Fletcher PA Lamina Propria and OlLiuet factory Bulb Ensheathing cells Exhibit Differential Integration and Migration and Promote Differential Axon Sprouting in the Lesioned Spinal Cord [J]. J Nuro sci, 2005(46)：10700-10711.

　　[10]Sasaki M,Karen L, Zemed kun LM,et al. Identified olfactory ensheathing sells transplanted into the transected dorsal funiculus bridge the lesion and form mylin [J]. J Neuro sci, 2004(39): 8485-8493.

　　[11]吴德模，于如同.腺病毒介导HIFla基因对大鼠脊髓损伤后NGb表达的影响[J].实用临床医药杂志，2007(05)：11.