白介素-13受体α2抗原肽致敏的DC-CIK细胞对人胶质瘤U251细胞的杀伤效应

　　作者：严欣江，苏志鹏，郑伟明，吴哲褒，叶盛 作者单位：温州医学院附属第一医院 神经外科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的:观察人脑胶质母细胞瘤特异性抗原(IL-13Rα2)致敏的同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)在体外对U251的细胞毒效应。方法：用密度梯度分离法获取HLA-A*0201+健康志愿者的人外周血树突状细胞(dendritic cells，DC)的前体细胞与淋巴细胞，并在体外诱导而获得成熟的DC细胞和CIK细胞。收获IL-13Rα2抗原负载的DC与CIK细胞共培养，使DC递呈肿瘤抗原予CIK细胞，并激活CIK细胞。激活的CIK细胞与U251细胞在96孔板内混合培养24 h后，以CCK-8试剂间接检测其对U251细胞杀伤率。结果：IL-13Rα2抗原肽成功负载DC，CIK细胞被负载抗原的DC激活并增殖;特异性抗原肽激活的CIK细胞对人胶质瘤U251细胞有杀伤效应(P<0.01)。结论：IL-13Rα2抗原肽激活的CIK细胞对人胶质瘤U251细胞有杀伤效应。

　　【关键词】 胶质母细胞瘤;IL-13Rα2抗原肽;树突状细胞;细胞因子诱导的杀伤细胞

　　Killing effect of interleukin-13 receptor alpha 2 (IL-13Rα2) sensitized DC-CIK cells on human glioblastoma U251 cells YAN Xin-jiang，SU Zhi-peng，ZHENG Wei-ming，WU Zhe-bao，YE Sheng. Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospitial of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To determine the cytokine induced killer(CIK) cells’cytot oxic effect in human U251 in vitro， after co-culturing with dendritic cells (DC) which was pulsed with IL-13Rα2 antigen that is highly and specifically express in human glioblastoma. Methods: The lymphocyte and the monocyte-derived DC generated from healthy HLA·A*0201+ positive donors peripheral blood and were separated using standard Ficoll-Hypaque gradient density centrifugation. DC were pulsed with interleukin-13 receptor alpha 2 peptide in vitro and then co-cultured with lymphocyte. After induced CIK cells and U251 cells were co-cultured 24 hours in 96 wells， CCK-8 were added every well equally. 2 hours passed and then，the OD value were detected and recorded. Results: On IL-13Rα2 antigen uptake，DC efficient presentation of the antigen to CIK cells， resulting in CIK cells activation and proliferation. The induced CIK cells showed specific lysis against human U251 cells(P<0.01). Conclusion: The results suggest that IL-13Rα2 antigen specific induced CIK cells can kill human glioma U251 cells.

　　Key words: glioblastoma;IL-13Rα2 antigen peptide;dendritic cell;cytokine induced killer cells

　　尽管胶质瘤的临床和基础研究有很大发展，但胶质瘤患者的预后仍未得到明显改善，特别是胶质母细胞瘤，平均生存期约为1年[1]。近年来，研究发现白介素-13α2受体(Interleukin-13 receptor alpha 2，IL-13Rα2)在恶性胶质瘤中存在特异性高表达[2-3]。由此，我们可以利用人外周血树突状细(dendritic cells，DC )递呈抗原信息，激活同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)来杀伤肿瘤细胞，因此IL-13Rα2有望成为恶性胶质瘤免疫治疗的有效靶点。

　　CIK细胞是迄今发现的所有免疫效应细胞中增殖能力最强、细胞毒活性较强的细胞。我们将DC与CIK细胞共培养，观察DC与同源CIK细胞共培养细胞(DC-CIK细胞) 的细胞毒活性的变化，并在体外观察其对人胶质瘤细胞株U251的细胞毒性作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂与细胞株 人胶质瘤U251细胞株(中科院上海生物细胞研究所)，人淋巴细胞分离液(新西兰Cedarlane公司)，RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物试剂公司)，rhIL-2、rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α (均为厦门特宝生物公司)，IL-13Rα2抗原肽(本实验室原核表达合成保存)等。

　　1.2 主要仪器 超净工作台(Telstar bio-II-A)， 倒置显微镜(LEICA DMIL)，细胞孵育箱(HARRIS USA)，水平高效离心机(BECHMAN USA)，全自动酶标仪(Elx800型，奥地利KIALAB公司)，扫描电子显微镜(S-3000N 日立公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 人胶质瘤U251细胞培养备用：将U251细胞约5×105个培养于含5 ml 1640完全培养基(含10%胎牛血清)的25 cm2培养瓶内，置于37 ℃，5% CO2条件下的孵箱内培养，每天观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。约3～4 d需传代一次。

　　1.3.2 外周血单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMC)的分离和培养:取HLA-A*0201+健康志愿者(无患结核、乙肝等慢性传染病，无患肿瘤、自身免疫性疾病及严重感染性疾病等)外周血30 ml，肝素抗凝后，用密度梯度分离(Ficoll-Hypague)法分离PBMC，用RPMI 1640完全培养液以3×106/ml调整细胞浓度，接种于6孔板内，置37 ℃，5% CO2 孵箱内培养4 h。

　　收集非贴壁细胞：用CIK细胞培养液(RPMI 1640+10%人AB血清+200 IU/ml rhIL-2)调整细胞浓度为5×105/ml，隔天换以新鲜CIK细胞培养液。

　　1.3.3 DC的诱导扩增培养：在上述留有黏附细胞的培养瓶中，加入含有RPMI 1640+10% FBS， rhGM-CSF、rhIL-4各1 000 U/ml的培养液;隔天换液一次，在DC培养的第4天，加入肿瘤抗原IL-13Rα2 20 μg/ml致敏，第5天加入rhTNF-α，第8天收集成熟的DC。

　　1.3.4 DC形态电镜观察：取培养成熟的DC，调整细胞浓度为1×105/ml，PBS洗涤离心，PBS重悬后加样于多聚赖氨酸包被的玻片，室温下静置10 min，2.5%戊二醛固定2 h;以后按照扫描电镜标本制作流程，最后真空干燥镀膜后扫描电镜观察。

　　1.3.5 诱导培养DC-CIK细胞：分别将诱导8 d的DC和CIK细胞以1:10的比例混合培养并加入IL-13Rα2 20 μg/ml和DC 400 μl(2.5×105/ml)+CIK 细胞 400 μl(2.5×106/ml)于24孔板中，培养基PRMI 1640+10%人AB血清+200 IU/ml rhIL-2;隔天换液，4 d后收获。

　　1.3.6 效应细胞(IL-13Rα2致敏的DC-CIK、未用IL-13Rα2致敏的DC-CIK及CIK)体外杀伤活性分析(CCK-8法)：将诱导培养的DC-CIK细胞和CIK细胞分别加适量培养液，计数调节细胞密度1×106/ml，经培养液倍比稀释后其密度各分别为：1×106/ml、5×105/ml及2.5×105/ml。靶细胞U251的准备：贴壁生长的U251细胞用胰蛋白酶消化液处理、离心后，以PBS悬浮细胞计数;用10%人AB血清 RPMI 1640调节细胞密度为1×105/ml。细胞毒活性检测：接种靶细胞U251，按每孔1×104个/100μl 于96孔平底细胞培养板中培养4 h后，按效靶比10:1、5:1及2.5:1分别将效应细胞加入96孔板中，每一效靶比下设3个复孔。经效应细胞培养液培养24 h后，去除上清，加入RPMI 1640+10% CCK-8液100 μl，最后测OD值。

　　计算杀伤率：杀伤率=[1-(AS-Ab)/AC-Ab]×100%，AS为实验孔(含有U251的培养基、效应细胞、CCK-8)，AC为对照孔(含有U251的培养基、没有效应细胞、CCK-8)，Ab为空白孔(不含U251和效应细胞的培养基、CCK-8)。

　　1.4 统计学处理方法 采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

　　2 结果

　　2.1 U251胶质瘤细胞生长及形态观察 胶质瘤细胞呈贴壁生长，胞体较大，多形性，有多个突起，培养24～48 h后进入指数增长期，第3天后细胞密度明显增加，胞体呈成纤维细胞样或多形性生长，如图1A。

　　2.2 DC的生长及形态 DC呈贴壁生长，在第2天，细胞胞体较小，部分区域出现细胞集落;第3～第5天，贴壁细胞明显增多，有少量悬浮细胞，并形成较多生长集落;细胞胞体明显增大，部分细胞周围可见少许伪足。在第5天加入TNF-α(25 ng/ml);第6～第8天，DC胞体较前明显增大，伪足增多、变长，悬浮细胞增多明显，部分细胞胞膜外周呈绒毛状(如图1B、图1C、图1D)，0.4%苔盼蓝染色计数示活细胞在95%以上。扫描电镜观察DC大小约10～20μm，细胞表面凹凸不平，呈树枝状，伪足长短不一(如图1D)。

　　2.3 CIK细胞的生长情况及形态 细胞呈悬浮状生长，第4天，可见部分集落形成，从第4天到第6天，淋巴细胞增殖集落逐渐增多，并且集落逐渐增大(如图2A～图2D)。

　　2.4 效应细胞对U251的细胞毒性作用 从图3A～图3C和表1可见，Peptide-DC-CIK细胞、DC-CIK细胞及CIK细胞在效靶比为10:1时对U251靶细胞的均有杀伤率作用，特别在效靶比10:1的条件下，Peptide-DC-CIK细胞组的细胞毒活性明显强于同等条件下的其他两组，并且Peptide-DC-CIK细胞在效靶比2.5:1～10:1范围内细胞毒活性逐渐增强。

　　3 讨论

　　目前，在胶质瘤免疫治疗中，研究较多的是以总RNA、肿瘤细胞裂解物以及凋亡的肿瘤细胞刺激DC制备肿瘤疫苗为主，由于这些方法制备的抗原肽具有成分的复杂性和不确定性，容易导致自身免疫性疾病的发生[4]。

　　DC体外负载肿瘤抗原后，回输体内可激活T淋巴细胞，对肿瘤形成高效而特异的杀伤。在国内外的研究中，DC在乳腺癌、骨髓瘤、恶性淋巴瘤、白血病、膀胱癌、甲状旁腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等的免疫治疗中取得一定疗效[4-7]。Liau等[8]通过胶质瘤抗原负载DC，肿瘤抗原-DC瘤苗回输患者体内后，发现机体内肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte， CTLs)显著增加，并且发现大量的CTLs浸润到胶质瘤组织内。Xue等[9]体内研究显示，胶质瘤-DC瘤苗能增强机体特异性抗瘤能力，以杀伤残留的病灶，防止术后复发或延缓复发，延缓寿命，改善生存期生活质量。

　　国内外众多学者[3，10-11]分别采用原位杂交、免疫组化染色及RT-PCR技术等不同的实验方法发现，82%以上高级别胶质瘤高表达IL-13Rα2，而良性星形细胞瘤和正常脑组织无表达或极低表达。 本实验先前研究[2]表明，在高级别胶质瘤中IL-13Rα2多肽及其mRNA呈高表达，低级别胶质瘤表达较低，而在正常的脑组织中则未见有表达，且其表达水平与胶质瘤的级别呈正相关。 本实验的先前研究者[12]还利用原核表达技术合成了IL-13Rα2抗原肽并在-70 ℃保存。

　　本研究的实验显示，采集正常健康自愿者的外周静脉血(HLA-A*0201+)，通过密度梯度分离 (Ficoll-Hypague)法分离获得PBMC，在体外细胞因子的诱导下增殖、发育，然后，在IL-13Rα2抗原肽负载DC后与CIK细胞共培养，CIK细胞被有效激活，并具有很强的增殖能力。在体外实验中，被抗原肽激活的CIK细胞对U251的细胞毒作用显著高于同源同期未被IL-13Rα2抗原肽激活的CIK细胞 (P<0.01)，说明DC已成功摄取胶质瘤细胞抗原，加工后经HLA-I类分子递呈给淋巴细胞，同时通过CD80、CD86共刺激分子及黏附分子等将其激活，对人胶质瘤U251细胞产生了特异性杀伤作用;同时，未经抗原致敏的DC刺激的CIK细胞不能特异性识别胶质瘤细胞，无HLA限制性，对胶质瘤产生的是非特异性杀伤，所以效率较低。在以往过继免疫疗法中应用淋巴因子激活的杀伤(lymphokine-acti-vated killer，LAK)细胞或CIK细胞，对肿瘤杀伤效率低，且副作用大[13-14]，也证实了这一点。

　　采用单一抗原肽IL-13Rα2负载DC后特异性激活CIK细胞，激活的CIK细胞特异性高效杀伤人胶质瘤U251细胞，从而避免了抗原肽成分复杂，产生自身免疫性疾病的风险。通过本实验的研究显示，IL-13Rα2抗原肽可以通过体外负载DC，在TNF-α作用下促使DC成熟，成熟的DC可以特异性激活CIK细胞并使其发生特异增殖，激活后的CIK细胞具有显著的人胶质瘤U251细胞的杀伤效应，且杀伤活性随着效靶比的增加而增加。 本研究为将来利用IL-13Rα2抗原肽进行单抗原激活免疫细胞在体治疗HLA-A*0201+的恶性胶质瘤患者奠定了理论基础，并且为其他单一抗原免疫治疗肿瘤防止发生自身免疫性疾病指明了方向。

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