小剂量伽玛刀照射对致大鼠脑神经元nNOS表达的影响

　　作者：梁军潮 徐波涛 作者单位：中国人民解放军广州军区广州总医院 1. 神经外科; 2. 神经内科; 3. 医学实验科， 广东 广州 510010

　　【摘要】 目的 通过观察低剂量伽玛刀照射对致大鼠大脑皮质及海马神经元nNOS表达的影响，初步探讨伽玛刀治疗癫的作用机制。 方法 将44只青霉素致大鼠模型等分为实验组和实验对照组，对实验组进行伽玛刀照射 (周边剂量12 Gy)，应用免疫组化方法检测两组大脑皮质及海马神经元nNOS表达的变化。 结果 nNOS在两组动物的皮质和海马表达均有显著性差别，实验组显著性低于实验对照组;实验对照组表达呈双高峰现象。 结论 nNOS在伽玛刀治疗癫的机制中具有重要作用。

　　【关键词】 放射外科手术 癫 一氧化氮合酶 一氧化氮 神经元 大鼠 Sprague-Dawley

　　in the cortex and hippocampus of experimental epileptic rats

　　LIANG Junchao1, XU Botao1, YANG Hongjun2, et al

　　1. Departments of Neurosurgery; 2. Neurology, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China

　　Abstract: Objective To explore the treatment mechanism of low-dose Gamma Knife radiosurgery for epilepsy by detecting the expression of nNOS in the cortex and hippocampus of experimental epileptic rats. Methods Forty-four penicillin-induced epileptic rat models were divided equally into experimental group and control group. Experimental rats were treated by Gamma Knife radiation at a marginal dose of 12 Gy. Expression of nNOS in both the cortex and hippocampus were detected immunohistochemically. Results After the irradiation, in both the cortex and the hippocampus, the expression of nNOS differed significantly between the experimental and control groups. The expression of nNOS in the experimental group was far less than that in the control group. The appearance of double peaks occurred in the control group. Conclusion The expression of nNOS plays an important role in the mechanism of Gamma Knife treatment for epilepsy.

　　key words: radiosurgery; epilepsy; nitric-oxied synthase; nitric oxide; neurons; rats, Sprague-Dawley 本实验通过检测正常大鼠和癫大鼠在伽玛刀照射前后神经元性一氧化氮合酶 (nNOS) 表达的变化，探讨伽玛刀治疗癫的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料 健康SD大鼠48只 (南方医科大学实验动物中心提供)，体质量200~250 g，雌雄不拘。石蜡包埋机 (上海医疗仪器厂)，石蜡切片机 (Leica2135，美国)，显微镜及摄影系统 (Nikon E-600，日本)。兔抗-nNOS (北京中山生物技术有限公司)，SP免疫试剂盒、DAB (神州边新生物技术开发公司)。

　　1.2 方法 制作青霉素致大鼠模型44只，等分为实验组和实验对照组。实验组以氯胺酮100 mg/kg行腹腔注射麻醉，固定于伽玛刀专用大鼠固定架 (自行设计)，进行脑冠状位磁共振成像连续扫描，确定照射靶区 (右顶皮质) 三维坐标。然后实施伽玛刀照射，采用4 mm准直器，周边剂量12 Gy，等剂量曲线50%，时间6 min。实验对照组麻醉后在伽玛刀治疗室内空置6 min。另取4只正常大鼠作为正常对照组，按制作青霉素致模型的方法，将青霉素改为等渗盐水。

　　将实验大鼠于伽玛刀照射后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d、30 d和60 d处死，每一时间点处死2只，取靶区皮质及海马标本，4%甲醛溶液4 ℃固定16~24 h，用石蜡切片机进行2 μm连续大脑冠状切片。每6片取1片进行免疫组化SP法检测，应用 DAB显色，每份样品同时作阴性对照、苏木精-伊红染色各1份。光镜观察，照相，阳性细胞计数。正常对照组大鼠分别在存活3 h、3 d、30 d和60 d处死，处理同前。

　　2 结 果

　　2.1 皮质

　　2.1.1 0.5~24 h： 实验对照组3 h可见神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞的细胞核和细胞质出现nNOS阳性反应，24 h达高峰。(图1)。实验组表达较实验对照组弱，阳性细胞少 (图2)。

　　2.1.2 3~7 d： 实验组与实验对照组nNOS阳性细胞数均明显减少，但实验组更明显。

　　2.1.3 14~30 d： 实验对照组nNOS阳性细胞数再度增加，30 d时可见nNOS阳性细胞表达为三种形式：①细胞质染色，突起也见染色;②细胞核及细胞质均染色;③仅细胞核染色 (图3)。实验组阳性表达增加不明显，突起无染色 (图4)。

　　2.1.4 60 d： 实验对照组靶区nNOS阳性反应更明显，以第一种形式为主，在树突及轴突中大量表达。实验组偶见阳性表达。nNOS在正常对照组未见有意义的阳性表达 (图5)。

　　2.2 海马

　　2.2.1 0.5~24 h： 实验对照组海马CA1、CA3区及齿状回门区可见明显的nNOS阳性神经元、神经胶质细胞和内皮细胞，实验组则表达较弱 (图6)。

　　2.2.2 3~7 d： 实验组与实验对照组nNOS阳性细胞均明显减少，仅偶见。

　　2.2.3 14~30 d： 实验对照组在上述区域再次出现较多的nNOS阳性表达，实验组阳性表达相对减弱。

　　2.2.4 60 d： 实验对照组nNOS阳性反应更明显，可见三种形式nNOS阳性细胞。实验组表达较少。nNOS在正常对照组未见有意义的阳性表达。

　　3 讨 论

　　一氧化氮 (NO) 是一种气体信使分子，在体内由左旋精氨酸在一氧化氮合酶 (NOS) 作用下发生双氧化反应生成;NOS是NO合成的必需酶，可间接反映NO水平，其激活依赖于胞质内Ca2+水平。生理状态下NO参与中枢神经系统突触传递，调节脑血流量，促进递质释放和调节突触可塑性。Talavera等[1]通过酶组织化学研究发现：在大鼠点燃模型中，随着点燃的进展，动物脑电波的释放和癫发作的持续时间增加;同时海马、尾状核及杏仁核内NOS阳性细胞数增加。但NO产生过多时，则产生毒性作用[2]。当谷氨酸 (Glu) 过度刺激N-甲基天冬酸 (NMDA) 受体时，钙离子通道开放，大量Ca2+内流，此时表达增高的NOS被激活，产生过量NO，诱发神经损伤，进一步加重癫发作。在可卡因癫模型中，发现NOS抑制剂L-硝基精氨酸甲酯 (L-NAME) 能显著减轻癫的行为症状，且有NMDA受体的激活[3]。提示NO可能与诱发癫时NMDA受体活性增强有关，NO可能参与了可卡因引起的中枢神经系统兴奋性增高。

　　Ca2+作为第二信使，对细胞的代谢功能具有重要的调节作用，可使刺激信号传递给细胞内各种酶反应系统或功能性蛋白。胞内钙浓度的增加在癫发生上具有重要作用[4]，Ca2+在多种不同刺激信号诱导的不同细胞凋亡中可能存在相似的最后通路[5]。青霉素诱导的局灶癫动物模型，主要通过电压依赖性钙通道和受体门控钙通道的Ca2+过量内流致性活动[6]。大量研究均表明：NO参与神经元的兴奋性过程，具有诱发癫的作用。NO诱发的癫与NMDA受体的激活、细胞内Ca2+浓度的变化及突触前膜谷氨酸释放增加相关。

　　本实验结果显示：低剂量伽玛刀照射致大鼠在抗癫的同时[7]，可明显抑制青霉素致大鼠脑皮质及海马nNOS的表达，提示低剂量伽玛刀照射的抗癫作用与其抑制脑内NO生成有关。由于NOS的活性与胞质内Ca2+浓度密切相关，因此我们认为：低剂量伽玛刀照射可作用于谷氨酸神经元NMDA受体，抑制谷氨酸的合成和释放;或通过降低谷氨酸受体的活性，减少Ca2+内流，从而间接抑制NOS活性，减少NO生成，同时也减少了对谷氨酸的正反馈作用，而达到抗癫的目的;也可能低剂量伽玛刀照射改变了微环境，使Ca2+离子通道改变，从而达到治疗癫的作用。

　　【参考文献】

　　[1] Talavera E, Martinez-Lorenzana G, Corkidi G, et al. NADPH- diaphorase-stained neurons after experimental epilepsy in rats [J]. Nitric Oxide, 1997; 1(6): 484-493.

　　[2] Libri V, Santarelli R, Nistico S, et al. Inhibition of nitric oxide synthase prevents magnesium-free-induced epileptiform activity in guinea-pig piriform cortex neurones in vitro [J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1997; 355(4): 452-456.

　　[3] Przewlocka B, Lason W, Machelska H, et al. The effects of cocaine-induced seizures on the proenkephalin mRNA level in the mouse hippocampus: a possible involvement of the nitric oxide pathway [J]. Neurosci Lett, 1994; 168(1-2): 81- 84.

　　[4] 李春香, 于明, 唐宁波, 等. 戊四唑致癫大鼠脑组织NO和MDA含量及其相关性研究 [J]. 临床神经病学杂志, 2002; 15(2): 100-101.

　　[5] Schuchmann S, Albrecht D, Heinemann U, et al. Nitric oxide modulates low-Mg2+-induced epileptiform activity in rat hippocampal-entorhinal cortex slices [J]. Neurobiol Dis, 2002; 11(1): 96-105.

　　[6] Murashima YL, Yoshii M, Suzuki J, et al. Ictogenesis and epileptogenesis in EL mice [J]. Epilepsia, 2002; 43(Suppl 5): 130-135.

　　[7] 梁军潮, 徐如祥, 王伟民, 等. 低剂量伽玛刀照射癫大鼠脑神经元的超微结构研究 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2005; 10(2): 83-85.