茶氨酸对D半乳糖衰老模型小鼠抗衰老作用的实验研究

　　作者：刘显明，李月芬，李国平 作者单位：1.青岛市市立医院东院区神经外科，山东 青岛 266071;2.青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003;3.青岛市中心医院，山东 青岛 266036

　　【摘要】目的 探讨茶氨酸的抗衰老作用及机制。方法 以D半乳糖致亚急性衰老小鼠为模型，采用Y电迷宫法检测各组小鼠学习记忆能力，酶法测定脑组织匀浆的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)和胆碱酯酶(AchE)活性。结果 与模型组比较，茶氨酸可明显提高衰老小鼠的学习记忆能力，提高SOD和AchE的活性，降低MDA含量(P<0.05,P<0.01)。结论 茶氨酸具有明显的抗衰老作用，其作用机制可能与其抑制自由基，促进中枢胆碱能的功能有关。

　　【关键词】 茶氨酸 D半乳糖 衰老 自由基

　　Antiaging effects of theanine on aging model mice induced by Dgalactose

　　LIU Xianming,LI Yuefen,LI Guoping

　　Department of Neurosurgery,Municipal Hospital of Qingdao,Qingdao 266071,China

　　Abstract： Objective To study the antiaging effects of theanine on aging model mice induce by Dgalactose.Methods After making the aging models by injecting Dgalactose,we determined the learning and memory abilities by "Y" maze and detected the activities of SOD,MDA,NOS and AchE by enzymatic method in brain tissue of the aging mice.Results Compared with model group,theanine significantly increased the learning and memory abilities of aging mice.It also increased the activities of SOD and AchE,decreased the amount of MDA(P<0.05,P<0.01).Conclusion Theanine has the antiaging effects on aging model mice and its mechanism may be related to its inhibitory effect on free radical and enhancement of central cholinergic fuction.

　　Key words:theanine;Dgalactose;aging;free radical

　　茶氨酸是茶叶中含有的一种不参与蛋白质组成的特殊氨基酸，在自然界中以L形态存在，L茶氨酸又名N乙基C谷氨酰胺，与L谷氨酸具有相似的化学结构[1]。国外研究表明茶氨酸具有降压、抗疲劳，增加多巴胺神经功能、促进神经生长、提高人体免疫能力等多种功效[2，3]。我国在茶叶的生产与消费上居于世界前列，但对茶氨酸的研究却相对滞后，仅处于对茶氨酸含量的测定和分析方法的研究上[4，5]，茶氨酸应用方面的报道较少，对衰老的预防作用还未见报道。本文采用D-半乳糖致亚急性小鼠衰老模型研究茶氨酸的抗衰老作用，为其推广应用提供客观依据。材料与方法

　　1 材料

　　6～8周龄昆明种小鼠40只，体重(20±2)g，雌雄各半，由河南医科大学实验动物中心提供。茶氨酸购自浙江大学泛科化工有限公司，白色针状晶体，样品含量≥99%，4℃冰箱保存备用。D半乳糖(上海试剂二厂)用灭菌的生理盐水配制成5%浓度。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)和乙酰胆碱酯酶(AchE)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Y型迷宫(Maze)箱(张家港市教学实验器械厂)，752型紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

　　2 模型的制备

　　将小鼠称重并随机分为5组：正常对照组，衰老模型组，茶氨酸低、中、高剂量组。正常对照组给予蒸馏水口服，同时在颈部皮下注射灭菌的生理盐水;衰老模型组给予蒸馏水口服;茶氨酸组分别给予6、12和24mg/kg(低、中、高剂量)茶氨酸(灌胃给药，每天1次，连续50天)，同时在小鼠颈部皮下注射5%的D半乳糖0.2ml(每天1次，连续50天)。实验期间小鼠自由摄食和饮水，每周记录体重1次。实验期末进行学习记忆测试，随后取脑组织称重并测定生化指标。

　　3 电迷路法测试小鼠学习记忆成绩

　　小鼠学习记忆测定在Y型迷宫箱中进行，以Ⅰ臂为起步区，Ⅱ臂为电击区，Ⅲ臂为安全区。实验期末将小鼠放入起步区，操纵电击控制器，若小鼠遭到电击时直接逃避至安全区为正确反应，反之则为错误反应，学习成绩以达到连续10次中有9次正确反应前所需的电击次数表示。学习48小时后进行记忆测试，记忆成绩也以达到连续10次中有9次正确反应前所需的电击次数表示。

　　4 小鼠脑组织生化指标的测定

　　给予D半乳糖及茶氨酸 50天并进行学习记忆成绩测试后，小鼠断头，迅速分离脑组织，用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，制成10%的组织匀浆用于各种生化指标的测定。用考马斯亮蓝改良法测定组织匀浆的蛋白含量。分别采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量，NOS和乙酰胆碱酯酶按试剂盒使用说明书的操作方法进行测定。

　　5 统计方法

　　结果以±s表示，采用PEM 3.1 统计软件进行统计分析，经正态性检验和方差齐性检验，采用多个样本均数比较的单因素方差分析和两两比较。

　　结 果

　　1 茶氨酸对衰老小鼠体重、脑重及学习记忆能力的影响

　　给予D半乳糖和茶氨酸50天，各组小鼠体重均增加，各组无显著性差异。模型组小鼠的脑重较对照组明显降低。茶氨酸组给予不同剂量茶氨酸后，脑重增加，尤以中剂量组明显(P<0.05,P<0.01)。小鼠Y迷宫学习记忆成绩明显降低，表明D半乳糖可以使小鼠的学习记忆辨别能力明显下降，在给予茶氨酸后，小鼠的学习记忆成绩提高明显(P<0.05,P<0.01)。其提示茶氨酸对D半乳糖所致小鼠的学习记忆损伤具有保护作用，中剂量组甚至可达到或超过正常对照组水平，结果见表1。表1 茶氨酸对衰老小鼠体重、脑重和学习记忆成绩的影响(略)

　　2 茶氨酸对衰老小鼠脑组织SOD、MDA、NOS和AchE含量的影响

　　给予D半乳糖后，小鼠脑中的SOD活性明显下降，MDA含量增加。同时给予不同剂量的茶氨酸能明显提高脑组织中的SOD活性，降低MDA含量(P<0.05,P<0.01)。模型组小鼠脑组织中的NOS和AchE活性降低，茶氨酸各组小鼠脑组织的AchE的活性明显高于模型组，并呈剂量依赖性(P<0.05,P<0.01)。NOS活性有一定程度下降，但无统计学意义，结果见表2。表2 茶氨酸对衰老小鼠脑组织生化指标的影响(略)

　　讨 论

　　建立衰老动物模型是进行衰老研究的关键，动物长期注射D半乳糖会引起全身代谢紊乱，产生各器官功能衰退，这一过程与机体的自然衰老过程相似，是衰老研究中常用的一种衰老实验动物模型[6]。自由基理论在衰老学说中占有重要地位，大量实验已经证实了自由基的致衰老作用，半乳糖衰老模型也得到了自由基衰老学说的支持和验证[7]。机体脂质过氧化反应随年龄而增加，同时伴有抗氧化系统机能下降，导致体内自由基浓度升高，超过机体的防御能力，造成细胞结构和功能损伤。国内外许多研究表明，D半乳糖早衰动物模型对自由基损伤和免疫指标的变化与人体衰老指标改变规律相似。D半乳糖可引起模型体内SOD活性下降、MDA增加、学习记忆障碍。氧自由基攻击生物大分子使SOD等合成减少，减弱了抗氧化酶清除氧自由基的能力[8]。本文结果显示，D半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠机体中SOD活性降低，MDA含量升高，提示在衰老过程中，氧自由基可以加速组织损伤，促进衰老。茶氨酸能够显著提高D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠机体组织SOD活性，降低MDA含量，表明茶氨酸是通过提高SOD的活性，降低脂质过氧化，从而达到延缓衰老的目的。

　　学习记忆与中枢胆碱能神经系统关系极为密切，胆碱能缺陷是导致衰老认知障碍的重要原因[9]。本研究成功复制了衰老模型并证实衰老模型学习记忆成绩明显下降，模型组小鼠脑组织胆碱酯酶活性明显降低，给予茶氨酸后小鼠的学习记忆成绩明显提高，AchE活性增高，说明茶氨酸是通过提高衰老模型小鼠脑组织AchE活性，促进了中枢胆碱能系统的功能而达到其恢复学习记忆能力的。研究证实NOS的变化也参与了衰老导致的学习记忆能力的减退[10]，本次实验中茶氨酸组小鼠脑组织中的NOS的活性高于模型组，但无统计学意义，说明茶氨酸对脑组织NOS的调节作用较弱。

　　综上，衰老的形成过程涉及多系统、多环节，本研究在成功制备了衰老模型的基础上探讨了茶氨酸的抗衰老作用，为其进一步应用提供了有力的实验依据。

　　【参考文献】

　　[1]凌关庭.可供开发食品添加剂：L茶氨酸及其生理功能[J].粮食与油脂，2003，(5)：46-49.

　　[2]Juneja LR.Ltheaninea unique aminoacid of green tea and its relaxation effect in humans[J].Trends Food Sci Technol,1999,(10):199-204.

　　[3]Eschemauer G,Sweet BV.Pharmacology and therapeutic uses of theanine[J].Am J HealthSyst Pharm,2006,63(1):26-30.

　　[4]李炎，陈昕.茶氨酸合成与应用[J].广州食品工业科技，1998，14(3)：23-26.

　　[5]郭升平.高效液相色谱法测定茶叶中茶氨酸的研究[J].色谱，1996，14(6)：464-466.

　　[6]徐淑云，卞如濂，陈修.药理学实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2002.179-181.

　　[7]龚国清，徐黻本.小鼠衰老模型研究[J].中国药科大学学报，1991，22(2)：101-103.

　　[8]李文彬，韦丰，范明，等.D半乳糖在小鼠上诱导的拟老化效应[J].中国药理学与毒理学杂志，1995，9(2):93-95.

　　[9]刘畅，王哲.阿尔茨海默病的胆碱能损害机制[J].中风与神经疾病杂志，2003，20(1)：89-91.

　　[10]Silveri GN,Mazzone M,Portale G,et al.Nitricoxide: a general review about the different roles of this innocent radical[J].Minerva Med,2001,92(3):167-171.