银染法观察甲状腺激素人工神经促进周围神经再生的研究

　　作者：王敏，杨志焕，潘君，Maquet V

　　(第三军大学新桥医院骨科，重庆 400037;第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042;重庆大学教育部组织工程重点实验室，重庆 400044;比利时列日大学化学系大分子研究教育中心)

　　摘要: 目的 用Bielschowsky神经纤维银染法观察再生有髓神经通过PDLLA-T 3 支架材料的情况及大鼠有髓再生神经纤维的数量。 方法 SD大鼠54只，分成PDLLA-T 3 、PDLLA组和自体移植组3组，同只大鼠右侧坐骨神经为正常对照。培养新生大鼠坐骨神经的雪旺细胞，将其种植在PDLLA-T 3 和PDLLA材料上备用，每只大鼠左侧坐骨神经经手术造成1cm缺损，然后分别用以上3组材料进行移植修复，在伤后2周、1个月、2个月3个时相点收集标本进行神经银染，染色结果通过图象分析仪进行分析，统计数据行t检验。 结果 伤后2周时各组均见新生的神经纤维通过神经移植段，各组之间无显著性差异，直到伤后1个月，2个月后，PDLLA-T 3 组好于PDLLA组，差异有显著性，P<0.05。自体移植组髓神经增加明显，高于其他2组，差异有显著性，P<0.05，但低于正常值。 结论 Bielschowsky神经纤维银染法观察大鼠神经再生效果满意，新生的神经纤维可以通过PDLLA-T 3 ，效果好于PDLLA。

　　关键词: 甲状腺激素;组织工程;周围神经;Bielschowsky神经纤维银染法

　　Study of effect of PDLLA-T 3 in peripheral nerve injury by method of silver staining

　　WANG Min，YANG Zhi-huan，PAN Jun，et al.

　　(Department of Orthopedics，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400037，China)

　　Abstract: Object To observe the number of regenerating myelinated nerve fibers that have passed through the scaffolds of PDLLA-T 3 by the method of Bielschowsky silver staining，which bridged the gap of10-mm length in rats's left sciatic nerves.Methods Fifty-four SD rats were divided into3groups:PDLLA-T 3 group，PDLLA group and nerve au-tograft group.A sciatic nerve gap of10-mm length in the left side was done by surgery in each rats，and the right nerve was collected as normal control.Schwann cells isolated from sciatic nerves of the new born rats were cultured for2weeks in vitro and then seeded onto the scaffolds of PDLLA-T 3 and PDLLA.The gaps in sciatic nerve were bridged with these scaffolds containing Schwann cells and nerve autograft respectively.Specimen were collected after2weeks，1month，2months respectively and stained by the method of Bielschowsky silver staining，all the results were analyzed by image ana-lyzer and then statistically treated by t-test.Results New myelinated nerve fibers were observed in the3groups after2weeks and1month，no significant difference was found among them.Two months later，more new fibers were observed in PDLLA-T 3 group than that in PDLLA group，the difference was significant，P<0.05，which was less than that of autograft group.Conclusion The scaffold of PDLLA-T 3 could bridge the nerve gap of10mm successfully，the regenerating myeli-nated nerve fibers could pass through the PDLLA-T 3 scaffold，there were more new fibers than that in PDLLA.Bielschowsky silver staining is satisfactory method to observe new myelinated nerve fibers.

　　Key words:triiodothyronine;tissue engineering;peripheral nerve;Bielschowsky silver staining

　　随着组织工程的发展，利用组织工程方法构建人工神经以修复周围神经缺损的研究日益受到重视。甲状腺激素(thyroid hormone，TH)不仅是中枢神经系统，也是周围神经系统生长发育非常重要的因素。甲状腺激素通过其核受体(NT3R)调节雪旺氏细胞及神经元中多种神经再生的相关基因而起作用的，效果好于单一的细胞神经营养因子或细胞外基质[1] 。因此，我们设计构建了一种新的甲状腺激素人工神经(PDLLA-T 3 )。该人工神经是一种含三碘甲状腺原氨酸-T 3 (Triiodothyronine)的聚乳酸组织工程神经，具有纵行管径立体结构。本实验拟对甲状腺激素人工神经桥接大鼠坐骨神经缺损后有髓神经纤维再生的情况进行组织学的评价。在研究神经组织的形态方面，Bielschowsky氏法较为理想，最大特点是在镜下可控制其反应程度或效果，能清晰显示神经组织，而结缔组织着色很淡，其方法较简洁。本实验采用Bielschowsky神经纤维银染法观察再生神经通过支架材料的情况及再生的数量。

　　材料与方法

　　1 动物分组

　　取SD大鼠54只，雌雄不限，每只大鼠下肢左侧坐骨神经为手术实验组，右侧为正常对照。实验分自体神经移植组(A组)，甲状腺激素人工神经组(B组，PDLLA-T 3 )，人工神经组(C组，PDLLA)，每组18只，分别于伤后2周、1个月、2个月3个时相点观察并收集标本。

　　2 甲状腺激素人工神经构建

　　取新生SD大鼠(7天以内)4～5只，引颈处死，用组织块培养法获得坐骨神经雪旺细胞。PDLLA-T 3 和PDLLA支架均由比利时列日大学(Belgium Liège University)化学系大分子研究教育中心制作合成，PDLLA-T 3 中每毫克PDLLA中含35ng的T 3 。支架材料经50μg.ml浓度的纤维粘连蛋白溶液涂附材料以增加细胞的黏附作用。将培养好的细胞与支架材料混合培养2周，细胞长入支架内，甲状腺激素人工神经构建完成，不含T 3 的PDLLA按同样方法构建。

　　3 手术方法

　　25g.L异戊巴比妥，50mg.kg腹腔注射(0.2ml.100g)，麻醉成功后，将大鼠四肢用橡皮筋固定好，俯卧位，剪去大鼠左髋关节周围的毛发，碘伏消毒，以大鼠左髋关节为起点顺下肢做纵切口，切开皮肤，显露股二头肌，暴露坐骨神经，仔细游离坐骨神经约2.0cm长，在距梨状肌下缘2～3cm处切除坐骨神经1.0cm长，形成坐骨神经1.0cm缺损，将实验准备好的培养有雪旺细胞的PDLLA和PDLLA-T 3 材料置入缺损区，上下两端无张力情况下各缝合两针，再用PLA膜将移植段包裹固定(图1)，缝合伤口，雌雄分笼饲养。

　　自体神经移植组手术方法同前，在距梨状肌下缘2～3cm处切除坐骨神经1.0cm长后，不改变方向原位用8-0缝线作自体神经移植，两个吻合口，缝合伤口。

　　图1 PDLLA和PDLLA-T 3 桥接神经缺损示意图(略)

　　4 将各时相点的大鼠处死后，显露原手术部位，以手术缝合线为标志，在距离吻合口的远近端各1cm的地方离断神经，取出，按原长度将其固定在一小竹片上，远近端分别用细线固定，以防止标本固定时标本回缩，影响观察，并作好标记区分远近端。

　　5 Bielschowsky神经纤维银染法固定:4%多聚甲醛液。

　　试剂配制:氨银溶液:20%硝酸银水溶液30ml，无水乙醇20ml。将此两液混合立即呈现乳白色沉淀，逐滴加入浓氨水，使之形成的沉淀刚刚溶解，再滴加5滴浓氨水，过滤后使用。

　　染色方法:(1)石蜡切片厚8～15μm，脱腊至水洗;(2)蒸馏水洗1～2分钟;(3)于37℃温箱内用2%硝酸银水溶液避光浸染25～35分钟;(4)蒸馏水洗2～3分钟;(5)用10%甲醛溶液还原数秒钟，至切片呈黄色为止;(6)蒸馏水洗3～5分钟;(7)用氨银溶液滴染20～40秒;(8)倾去染液，直接用10%甲醛溶液再次还原1～2分钟，使之切片呈棕黄色;(9)蒸馏水洗3～5分钟;(10)用0.2%氯化金水溶液调色3～5分钟;(11)蒸馏水洗1～2分钟;(12)用5%硫代硫酸钠水溶液固定3～5分钟;(13)水洗3～5分钟，然后用滤纸将切片周围水份吸干;(14)乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

　　6 图像分析

　　银染结果在Motic image advanced2.0图像分析系统上做分析，全部实验数据用SPSS10.0软件进行统计学处理，t检验。

　　结果

　　材料组(PDLLA组和PDLLA-T 3 组)伤后2周时，可以看见材料尚未完全降解形成的大小不一的空腔，中间已有组织长入，伤后1个月后，材料内部有较多的再生组织，但材料仍未降解完，残留材料空下许多条索样空白区。伤后2个月后，材料基本降解完，未见空白条索区，神经等组织充满材料区，甚至可见有血管再生。

　　标本进行银染后，有髓神经纤维呈黑色细条样，同向而行，波浪状，数量不等，长短不等，粗细不等，疏密不等，如果恰好切到神经轴突的中间，可以看到黑色有髓神经纤维中间的空白线。各组各时间段均有阳性反应纤维。

　　图像分析显示，伤后2周时，各组的有髓神经纤维都较少，每个视野只有约25～30个，自体移植组较多，但统计分析其差异性并无显著性，各组间P>0.05。1个月后3组均有显著的增加，大约增加一倍左右，各组之间仍无显著性差异。2个月后，甲状腺激素人工神经组好于C组，差异有显著性，P<0.05。自体移植组有髓神经增加得明显更多，达到81个左右，高于两个材料组，与它们相比差异有显著性，P<0.05，但低于正常值，和正常组相比差异有显著性。分析结果见图2。

　　图2 神经银染图像分析结果(略)

　　讨论

　　周围神经缺损的重建修复是周围神经外科中的一大难题。目前应用的自体移植神经，由于其富含雪旺细胞和神经束结构，被公认为是修复神经缺损的黄金标准[2] ，目前尚无人工神经材料或其它修复方法超过自体神经移植方法，国际上开展用不同高分子可降解材料对神经诱导修复的研究都还处在实验研究阶段[3] ，国内也在开展这项工作[4，5] ，但修复长度未超过10mm[6] 。在高分子设计的基础上通过对材料组分、组成比、分子量、分子量分布等的控制，可以合成一系列具有不同降解速度及力学性能的材料，并可调节材料的生物降解速度在几周至几年间变化。对不同动物，甚至不同的神经，由于再生速度和神经缺损距离的不同，需要有不同降解时间的材料，本实验证实大鼠神经损伤2个月后，PDLLA-T 3 材料基本降解完，神经组织再生良好，其降解速度和神 经再生的速度基本上是匹配的，这有利于再生神经组织的重新构建。

　　本实验选择自体神经移植和不含甲状腺激素的PDLLA作为对照实验组，应用Bielschowsky神经纤维银染法先从组织学上观察甲状腺激素人工神经修复周围神经后神经再生的情况。实验观察到2个月后这些材料的新生神经组织内还有血管的生成(待发表)，对神经组织非常重要，是局部血液循环重建的结果[7] ，目前文献报道较少。

　　Bielschowsky神经纤维银染法主要染色有髓神经纤维。目前有髓神经纤维的染色方法大多数采用甲苯氨蓝观察神经横截面的数量，但不易观察到整个移植神经段的有髓神经再生情况。本实验采用银染的方法进行纵切面的染色，比较容易观察到有髓神经通过支架材料的情况。但银染方法比甲苯氨蓝染色复杂些，统计时容易产生一定的误差，但如果采用同一个标准，可以减小甚至消除误差。本实验在同一个图象分析系统进行分析，采用相同参数(灰度等)进行比较分析。

　　有髓神经数量和百分比的增加有利于大鼠损伤下肢运动功能的恢复，本实验通过银染的方法证实PDLLA-T 3在周围神经髓鞘化中的作用，银染图象分析显示在伤后2个月后，虽然PDLLA-T 3 组大鼠的有髓神经数量仍低于自体移植组和正常组(P<0.05)，但多于PDLLA，统计分析有显著差异，本实验通过2个月的观察，证实通过支架中甲状腺激素的释放，PDLLA-T 3 起到了一定的促进周围神经再生的作用，效果好于PDLLA，提示周围神经再生过程中，局部长期加入合适的甲状腺激素可以起到有效促进周围神经再生的作用。

　　实验还发现，伤后2周，PDLLA-T 3 组和PDLLA组的再生神经首先是出现在材料的中央，而不是外周，从理论上讲在初期，材料的营养获得靠渗透，所以，外围营养应该更多更丰富，有利于物质的交换，Maquet等[8]发现大部分的再生神经纤维是在支架材料的外周，甚至外膜下，而中间较少。但本次实验却出现相反的结果，原因还不清楚，对PDLLA-T 3 组，可能材料降解时，中间材料较多，降解也较多，所以中间的游离T 3 较多，更有效的刺激雪旺细胞及再生神经增生，髓鞘化。而PDLLA组可能的因素也很多，如材料的构型、降解速度，分子量等，有待进一步研究。

　　参考文献:

　　[1] Barakat Walter I.Role of thyroid hormones and their receptors in peripheral nerve regeneration[J].J Neurobiol，1999，40(4):541-559.

　　[2] Berger A，Millesi H.Nerve grafting[J].Clin Orthop，1978，133:49-55.

　　[3] Meek MF，Den Dunnen WF，Schakenread JM，et al.Peripheral nerve regeration and functional recovery after reconstruction with a thin-walled biodegradable poly(DL-lactide-ε-caprolac-tone)nerve guide[J].Cells Mater，1997，7(1):53-62.

　　[4]王身国，侯建伟，贝建中，等.组织工程及周围神经修复―聚d，l-乳酸管诱导神经修复的研究[J].中国科学(B辑)，2001，31(2):109-114.

　　[5]沈尊理，Alfred B，Robert H，等.组织工程化人工神经修复长段神经缺损实验的初步报告[J].中华手外科杂志，2001，17(2):112-115.

　　[6] Rodriguez FJ，Gomez G，Perego G，et al.Highly permeable poly-lactide-caprolactone nerve guide enhance peripheral nerve re-generation through long gaps[J].Biomaterials，1999，20:1489-1500.

　　[7] Stock UA，Vacanti JP.Tissue engineering:current state and prospects[J].Annu Rev Med，2001，52:443-451.

　　[8] MaquetV，Martin D，Malgrange B，et al.Peripheral nerve regen-eration using bioresorbable macroporous polylactide scaffolds[J].J Biomed Mater Res，2000，52(4):639-651.