顽固性颞叶癫疒间海马超微结构的体视学分析

作者：马志国,杨梅华,刘仕勇

作者单位：中国人民解放军第三军医大学新桥医院神经外科， 重庆市 400037

   【摘要】  目的 对顽固性颞叶癫疒间病人的海马癫疒间灶组织和癫疒间灶周围正常组织的超微结构进行形态定量观察，以探讨颞叶癫疒间的发生机制。 方法 对45例病人在深部电极监测下手术切除海马，电镜观察癫疒间灶组织和癫疒间灶周围正常组织中锥体细胞和突触结构的形态学变化；采用体视学分析颞叶癫疒间灶组织和癫疒间灶周围正常组织锥体细胞线粒体体积密度 （Vv）、面积密度 （Sv）、数密度 （Nv）、比表面积 （δ）、平均体积 （V）；测量突触间隙的宽度。 结果 癫疒间灶组织锥体细胞线粒体较癫疒间灶周围正常组织明显肿胀，且嵴断裂，数量减少，平均截面积增大；线粒体的Vv、V较癫疒间灶周围正常组织大，Sv、Nv、δ较癫疒间灶周围正常组织小。癫疒间灶组织中锥体细胞的轴突和树突内线粒体较癫疒间灶周围正常组织的锥体细胞肿胀明显；轴棘、轴树突触间隙宽度变窄。 结论 海马锥体细胞超微结构的改变和细胞线粒体功能变化与顽固性颞叶癫疒间的发生关系密切。

【关键词】  癫疒间 海马 显微镜检查 电子 体视学

    Stereological analysis of ultrastructures of the hippocampus

    in the patients with intractable temporal lobe epilepsy

    MA Zhiguo, AN Ning, YANG Hui, et al

    Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 40037, China

    Abstract:  Objective  To explore pathogenesis of epilepsy by quantitative observation and stereological analysis of the ultrastructures of the epileptic foci and their surrounding normal tissues of the hippocampus in temporal lobe epilepsy.  Methods  The hippocampus was resected under monitoring of a deep electrode in 45 patients with intractable epilepsy  and the ultrastructures of pyramidal cells and synapses in the epileptic focus and surrounding normal tissues of the focus were observed under electron microscope for the morphological changes, and then the mitochondria in the pyramidal cells were determined stereologically for volume density (Vv), surface density (Sv), numerical density (Nv), specific surface (δ) and mean volume (V). The width of the synaptic cleft was also measured.  Results  The ultrastructural changes of the epileptic foci were obvious, including swelling, degeneration and decrease in number of the mitochondria, marginal collection of heterochromatin, mitochondrial swelling and fragmentation of the mitochondrial cristae. The Vv and V of the mitochondria in epileptic foci increased and the Sv, Nv and δ decreased as compared with those in the normal tissues of the hippocampus. The synapses and dendrites of pyramidal cells in the epileptic focus were obviously more oncotic than those in the surrounding tissues. The width of the synaptic cleft became small. Conclusion  The changes in the ultrastructures and mitochondrial function of the pyramidal cells in the hippocampus may play an important role in the mechanism of epileptic seizure and the development of intractable temporal lobe epilepsy.

Key words:  epilepsy;  hippocampus;  microscopy, electron;  stereology

       我科自2004年1月~2005年6月手术治疗顽固性颞叶癫疒间45例，术后对癫疒间灶组织和癫疒间灶周围正常组织的超微结构进行形态定量观察，以探讨颞叶癫疒间的发病机制。

    1    材料与方法

    1.1    临床资料    男28例，女17例；年龄4~49岁，平均16岁。病程4~32年。均服用过多种 （≥4种） 抗疒间药，且病程后期同时服用2~3种抗癫疒间药仍不能控制癫疒间发作。服药状态下仍每天发作数次。发作形式表现为单纯强直阵挛发作12例，复杂部分性发作6例，单纯部分性.作进展为全身发作19例， 强直阵挛发作合并失神发作8例。

    1.2    标本留取    术中应用深部电极监测海马出现尖波和棘波的部位，确定癫疒间灶后在显微镜下切除并留取标本作为癫疒间灶组织，立即复查EcoG，见癫疒间波消失或基本消失。同时取癫疒间灶边缘无癫疒间波的海马组织作为癫疒间灶周围正常组织， 进行对照。按常规电镜标本制作超薄切片：组织块迅速浸入2.5%戊二醛中前固定，2%锇酸 （OsO4） 固定 （4℃），PBS漂洗，脱水，浸透，环氧树脂包埋，修块，半薄切片，染色，超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，HU-12A型电镜观察并照相。

    1.3    测量指标

    1.3.1    图像定量分析：    在电镜下，按随机抽样原则从每例标本中选取3张超薄切片，每张切片选2个锥体细胞拍照，每例标本拍6张照片，癫疒间灶组织和癫疒间灶周围正常组织各拍270张照片。然后对锥体细胞内的线粒体平均截面积、单位面积内线粒体数量进行图像定量处理。通过显微摄像机将图像输入Quantimet-720型自动图像分析仪，所得数据进行方差分析。

    1.3.2    轴棘、轴树突间隙宽度测定：    每例标本随机拍摄轴棘、轴树突触各10张照片，在读数显微镜下，用测微尺测量突触间隙的宽度，将所得数据进行方差分析。

    2    结    果

    2.1    疒间灶锥体细胞    细胞体浓缩变小，固缩深染，电子密度增高，细胞核浓缩变形，核膜出现皱缩，深染。核膜内陷，核间隙扩张 （图1）。严重者胞质浓缩变少，呈网条状，线粒体增多，肿胀，大小不等，基质不均或增浓，嵴断裂模糊甚至消失，呈絮状结构，核糖体解聚，溶酶体增多，核膜不清或细胞核消失，细胞器结构不易分辨。变性的神经细胞周围常有水肿的星形胶质细胞和小胶质细胞的突起包绕。

    2.2    疒间灶突触与神经毡    突触前膜、突触前轴突末梢及突触后膜、突触后树突均发生不同程度的水肿，尤以突触后膜水肿多见且严重。突触前膜突触小泡聚集、增多，突触间隙变宽 （图2）。病变严重的突触细胞膜被破坏，水肿的突触和星形胶质细胞突起使神经毡呈疏松的网状结构 （图3）。

    2.3    海马疒间灶组织和正常组织线粒体体视学参数    疒间灶锥体细胞线粒体的体积密度 （Vv）、面积密度 （Sv）、平均体积 （V） 值大于正常锥体细胞组，组间Sv和V值差异有统计学意义 （P < 0.05），组间Vv值差异无统计学意义 （P > 0.05）；疒间灶锥体细胞数的密度 （Nv）、比表面积 （δ）值小于正常锥体细胞组，组间Nv和δ值差异有统计学意义 （P < 0.05） （表1）。疒间灶轴棘、轴树突间隙宽度明显小于正常组织，组间差异显著 （P < 0.05） （表2）。

3    讨    论

    顽固性颞叶癫疒间海马和正常海马的形态结构在超微结构上存在着明显差别。采用体视学方法可通过多个体视学参数从量化角度反映有关组织和细胞的三维结构特征，从而对不同形态结构的组织和细胞进行定量分析、描述和鉴别。以往对顽固性颞叶癫疒间病灶线粒体超微结构的研究为定性观察，近年来的研究发现海马癫疒间灶锥体细胞肿胀，线粒体平均截面积增大，数量减少；线粒体肿胀、嵴断裂；粗面内质网严重脱颗粒，网池扩张；游离核糖体减少。本实验通过定量测试和分析，从三维水平和量化角度揭示了顽固性颞叶癫疒间海马疒间灶线粒体和突触的超微结构的定量改变特点。

    因线粒体Vv反映单位体积内线粒体体积，与线粒体的体积、数量和大小有关；Sv反映平均单位体积内线粒体的表面积大小，与线粒体的数量、大小和形状有关；NA反映平均单位体积内线粒体的数量；NA越大，表明线粒体数量越多，细胞功能越旺盛；线粒体δ反映其与周围环境的接触程度，线粒体δ大说明进出线粒体的反应底物较多，物质交换较频繁，线粒体功能旺盛[1]。线粒体的体积减小，数量增加，扩大了与外界的接触面积，提高了ATP的合成[2]。本实验结果表明：顽固性颞叶癫疒间海马癫疒间灶锥体细胞线粒体的Vv、Sv、V大于正常锥体细胞，且差值明显；Nv、δ则与之相反。根据参数定义可知癫疒间灶神经细胞中单位体积细胞质中线粒体的膜面积和数目明显减少，这可导致疒间灶神经细胞线粒体的生物氧化产能的结构基础相对下降，氧化代谢减弱。正常锥体细胞的单位体积细胞质中线粒体的膜面积和数目明显增大，且呈密集增生状态，表明癫疒间灶周围的神经细胞能量代谢非常旺盛，其能量代谢较癫疒间灶更为活跃。因此，癫疒间灶锥体细胞与正常锥体细胞相比，其线粒体数目减少，形态更大更不规则，线粒体肿胀，嵴膜面积减小，嵴变得短而少；线粒体的生物氧化产能功能的结构基础相对下降。

    本实验发现癫疒间灶神经突触前膜、突触前轴突末梢、突触后膜及突触后树突均发生不同程度的水肿，部分尤以突触后膜水肿明显，同时伴突触前膜的突触小泡聚集、增多。这说明癫疒间发作时确有兴奋性突触参与，突触功能增强，产生棘波放电，突触前轴突末梢小泡聚集增多，使突触前膜发生水肿，在癫疒间动物模型观察也发现突触后树突水肿[3，4]。神经毡中轴突和树突内线粒体明显肿胀、嵴断裂，突触间隙宽度明显变窄。有人认为突触间隙变窄可能加快兴奋传导。综上所述，结合本实验结果提示，顽固性颞叶癫疒间的发病与疒间灶和疒间灶周围神经细胞线粒体代谢有关，且与突触结构的变化有密切关系。

【参考文献】  [1] 马志国, 秦毅, 速家震, 等. 体视学分析GM1对移植后的肾上腺髓质的作用 [J]. 解剖学杂志, 2000; 23(5): 414-417.

[2] Dashtipour K, Tran PH, Okazaki MM, et al. Ultrastructural features and synaptic connections of hilar ectopic granule cells in the rat dentate gyrus are different from those of granule cells in the granule cell layer [J]. Brain Res, 2001; 890(2): 261-271.

[3] Lynd-Balta E, Pilcher WH, Joseph SA. AMPA receptor alterations precede mossy fiber sprouting in young children with temporal lobe epilepsy [J]. Neuroscience, 2004; 126(1): 105-114.

[4] Cavazos JE, Jones SM, Cross DJ. Sprouting and synaptic reorganization in the subiculum and CA1 region of the hippocampus in acute and chronic models of partial-onset epilepsy [J]. Neuroscience, 2004; 126(3): 677-688