Sema3AFc真核表达载体构建及诱导少突胶质细胞祖细胞迁移作用观察

　　作者：陈焕然，黄其林，杨辉，马玉新，张伟 作者单位：第三军医大学新桥医院神经外科，重庆 400037

　　【摘要】目的 构建真核表达载体pIGSema3AFc,并观察Sema3AFc融合蛋白对少突胶质细胞祖细胞(OPCs)迁移的作用。方法 运用DNA重组技术自原核表达载体上将鸡来源的Sema3A基因克隆到真核表达载体pIGIgG1Fc上，并用双酶切、测序法进行鉴定。采用脂质体法转染非洲绿猴肾细胞株(COS7)细胞进行融合蛋白表达，培养3天后提取上清液，经蛋白A亲和纯化，Western blotting 进行鉴定。利用插入式细胞迁移小室(millicellPCF)细胞迁移仓观察其对OPCs细胞迁移的诱导作用。结果 重组质粒双酶切产生了2.24kb目的片段及5.7kb载体片段。测序证实构建的Sema3A膜外区与Sema3AFc cDNA 阅读框完整，连接部位序列正确;Western blotting证实有Sema3AFc融合蛋白表达。迁移试验证明其对少突胶质细胞祖细胞迁移具有推斥作用。结论 成功构建了Sema3AFc真核表达载体,并使有生物学活性的Sema3AFc融合蛋白在COS7细胞上获得了稳定表达，为进一步研究OPCs细胞定向迁移奠定了基础。

　　【关键词】 Sema3A Fc融合蛋白 真核表达 细胞迁移

　　Construction of Sema3AFc eukaryotic expression vector and its induction of oligodendrocyte precursor cells migration

　　CHEN Huanran,HAUNG Qilin,YANG Hui,et al.

　　Department of Neurosurgery,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037，China

　　Abstract： Objective To construct Sema3AFc eukaryotic expression vector and to observe effect of the sema3A-Fc fusion protein on inducing oligodendrocyte precursor cells migration.Methods Chicken sema3A gene base sequence derived from prokaryotic expression vector pBluescript Sema3A was inserted to multiple clone sites of pIG vector by DNA recombinant technique.After sequencing,the right recombinant was transfected into COS7 cells with lipofectamine reagent. Sema3AFc protein was purified by recombined protein A affinity column chromatography.The sema3AFc molecular was identified by western blotting,and its biological activity was reviewed through millicellPCF cell migration chamber.Results The openreading frame of Sema3AFc gene was coincident with what we had expected.Sema3AFc protein expression in COS7 cells was confirmed,and the purified Sema3AFc protein could promote oligodendrocyte precursor cells migration on the opposite direction.Conclusion The vector is constructed successfully and a purified recombined Sema3AFc protein is obtained.This lays a foundation for further studies of sema3A,such as its role in cell migration.

　　Key words：Sema3AFc fusion protein;eukaryotic expression;cell migration

　　Sema3A属于semaphorins信号蛋白家族，是目前发现的最强的轴突诱向分子，在神经系统等发育过程中起重要作用。近年来研究发现其还参与调控细胞的定向迁移过程[1]。在研究中枢神经损伤后神经纤维再髓鞘化时发现，室管膜下区少突胶质细胞祖细胞(OPCs)能否迁移到损伤区成为神经功能修复的关键问题之一。因此，Sema3A作为重要的诱向分子，是否在诱导OPCs细胞定向迁移中起重要作用?及其具体的信号转导机制如何?对此类问题目前尚知之甚少。为进一步研究Sema3A诱导OPCs细胞迁移机制，本研究拟构建Sema3AFc真核表达载体，现报告如下。材料与方法

　　1 实验材料与试剂

　　带有鸡来源的Sema3A基因的原核表达载体pBluescriptSema3A、真核表达载体pIGIgG1Fc由英国Britta J. Eickholt教授惠赠;大肠杆菌DH5a菌种及非洲绿猴肾细胞株(COS7)由本校新桥医院中心实验室保存。限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ、T4连接酶(日本Takara公司);质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒(Omega公司);达尔伯克改良伊氏培养基(DMEM)培养基(Hyclone公司);重组蛋白A亲和层析柱(1ml，购自北京韦氏博慧色谱科技有限公司);脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司);羊抗人IgG1Fc抗体(美国immunology consultants laboratory,Inc);HRP标记的兔抗羊IgG(北京中山公司);蛋白质Maker(pierce公司);核酸蛋白分析仪DU800(美国Beckman公司);凝胶成像系统、Western blot半干转印仪(美国BioRad公司);细胞培养箱(德国Heraeus公司)。

　　2 实验方法

　　2.1 pBluescriptSema3A、pIG1Fc质粒的扩增及提取

　　用CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态菌，转化pBluescriptSema3A、pIG1Fc质粒，涂在制备好的含100ng/ml氨苄青霉素LB培养板上，次日挑取转化成功的单菌落进行扩增，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，用核酸蛋白分析仪测定质粒DNA的含量和纯度。

　　2.2 Sema3A目的片段及pIG1Fc载体片段胶回收

　　分别对提取的质粒pBluescriptSema3A和pIGIgG1Fc进行(限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ)双酶切鉴定，并将酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像仪显示下将Sema3A目的片段及pIG1Fc载体片段条带切下，用胶回收试剂盒进行回收。

　　2.3 目的片段及载体片段的连接反应

　　按T4DNA连接酶说明书进行，建立如下反应体系：

　　10×T4DNA连接酶Buffer 2.5μl

　　Sema3A基因片段 8μl

　　pIGIgG1Fc载体片段 2μl

　　T4DNA连接酶 1μl

　　灭菌双蒸水 11.5μl

　　总体积 25μl

　　16℃金属浴反应过夜，次日直接取连接反应物10μl转化DH5a感受态菌，制备含100ng/ml氨苄青霉素LB转化平板。37℃培养过夜，次日挑选单菌落进行扩增培养，提取重组质粒，命名为pIGSema3AFc。

　　2.4 重组质粒鉴定

　　将提取的重组质粒进行HindⅢ、BamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，再送Takara公司进行测序，将测定的序列与基因库(GeneBank)中的基因进行同源性比对，鉴定目的基因序列的正确性。

　　2.5 脂质体法转染COS7细胞

　　用含10%小牛血清的DMEM培养基培养COS7细胞，至细胞铺满90%时，用脂质体2000按说明书进行转染。用绿色荧光蛋白EGFP质粒做阳性对照，用抗生素pIG1Fc空质粒进行阴性对照。用G418筛选,收集上清液。

　　2.6 荧光免疫组化法检测融合蛋白表达

　　重组质粒转染COS7细胞，24小时后终止培养，固定，用正常羊血清进行封闭，用羊抗人IgG1Fc抗体作为一抗，用抗体稀释液作阴性对照，兔抗羊免疫荧光试剂盒进行免疫荧光显色。

　　2.7 融合蛋白的Western blot检测

　　基因转染后添加牛血清白蛋白以促进融合蛋白的表达和分泌，3天后收集培养上清，用灭菌的0.22μm滤膜过滤，分装-70℃保存备用，同时用裂解法提取培养细胞总蛋白。灌制10%的分离胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在半干转印仪上用100mA衡定电流将目的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭后将膜用羊抗人IgG1Fc抗体4℃孵育过夜，次日用HRP标记的兔抗羊IgG室温孵育2小时，DAB显色。

　　2.8 Sema3AFc融合蛋白诱导细胞迁移试验

　　用millicellPCF细胞迁移小室(孔径8μm)进行细胞迁移试验。将稳定表达Sema3AFc的COS7细胞培养在迁移仓下层，待细胞融合达70%以上后，将纯化培养的少突胶质细胞祖细胞按1×109/ml接种在迁移仓的上层，共培养24小时，分别固定上下层的细胞，计数迁移细胞数，并与对照组比较计算细胞迁移率。根据下仓培养细胞种类分为3组：转染pIGSema3AFc的COS7细胞组，转染pIG1Fc的COS7细胞组，单纯培养基对照组。

　　3 统计学处理

　　定量数据以均数±标准差表示，用SPSS10.0统计软件对数据进行分析，使用独立样本t检验分析两个组间的差异，使用间因素方差分析比较多个组间统计学差异。

　　结 果

　　1 重组质粒的双酶切鉴定

　　对筛选的阳性重组子经HindⅢ+BamHⅠ双酶切鉴定后与预期符合。图1第3泳道示重组质粒双酶切后产生的两个片段：2.24kb目的片段及5.7kb载体片段，其大小分别与目的片段和载体片段大小一致，初步证实重组质粒构建成功。

　　2 重组质粒的测序鉴定

　　将Takara公司测得的重组质粒序列在GeneBank中用Blast软件进行同源性比对，证实重组质粒与基因库中的Sema3A基因序列同源。T7单向测序未发现错配或突变，进一步证实了构建的pIGSema3AFc质粒结构正确。

　　3 融合蛋白荧光免疫细胞化学检测

　　转染COS7细胞24h后，用抗人IgG1Fc抗体进行荧光免疫细胞化学染色，结果显示红色特异性染色位于胞浆内。表明重组质粒转染后能够正常进行融合蛋白的表达(图2A)。

　　4 融合蛋白的纯化及Western blotting分析

　　表达上清样品，通过A蛋白亲和层析柱分离纯化，用柠檬酸缓冲液洗脱时，有一明显的洗脱峰，为目的蛋白，而未转染的对照组则无。Sema3A基因编码约750个氨基酸，去掉C末端20个氨基酸，连接上IgGFc片段，通过软件DNA Star测算该融合蛋白单体分子量约为108kDa。收集洗脱峰，加DTT还原后进行SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色，在110kDa处可见1条蛋白带，与预期结果相符。将蛋白转移至硝酸纤维膜上，以羊抗人IgG1Fc抗体为一抗，HRP标记的兔抗羊IgG为二抗，Western blot 结果显示在110kDa处有1条特异条带,而对照组则无特异性染色,提示该条带即为Sema3AFc融合蛋白(图3) 。

　　5 融合蛋白诱导OPCs细胞迁移试验

　　用millicellPCF细胞迁移小室(孔径8um)进行细胞迁移试验，根据下仓培养细胞种类分为3组，每组样本数为6，每个样本随机计数5个视野，重复试验3次。统计结果如表1和图4所示。

　　表达Sema3AFc的实验组中OPCs向下层迁移的细胞数量较对照组显著减少,P<0.01。表明Sema3AFc融合蛋白对OPCs细胞迁移产生一定的影响，对OPCs细胞迁移运动具有反向推动(推斥)作用。表1 融合蛋白Sema3AFc诱导OPCs细胞迁移结果(略)

　　讨 论

　　Semaphorin3A(Sema3A)是近年来发现的作用最强的轴突诱向分子，它含有1个约500个保守氨基酸序列的Sema结构域，该结构域的完整性是保持其功能的重要基础。本文构建的Sema3AFc融合蛋白具有完整的Sema结构域，由于与Fc段的连接在铰链区，故不影响融合的两部分正确折叠，也不影响Sema3A与其受体分子结合。Eickholt等[2]通过实验证实Sema3AFc融合蛋白只要具有完整的Sema结构域就能发挥其生物学活性。本文亦初步观察到构建的Sema3AFc对OPCs细胞迁移具有明显的影响作用，表明其具有生物学活性。

　　本文通过真核表达质粒pIG构建的Sema3AFc分子，为一种分泌性蛋白分子，表达后能直接分泌到上清液中，在细胞外通过与其特异性膜受体neuropilin和plexin结合介导生物学效应。由于其融合了IgGFc片段，故可以在表达过程中利用抗IgGFc抗体检测表达情况，表达后还可利用蛋白A亲合层析法进行纯化。由于该纯化法特异性高，因此在后续蛋白功能研究时能很好地排除其它蛋白质的干扰，纯化后通过测定其浓度和含量，为定量研究提供可能[3]。另外，利用构建的Sema3AFc不仅可以对Sema3A蛋白功能进行研究，还可以对Sema3A受体进行检测和分析，即利用抗IgGFc抗体与Fc片段的结合来分析Sema3A受体在组织中的表达和分布情况。

　　Sema3A已被证实在神经发育时能直接诱导少突胶质细胞袓细胞(OPCs)迁移[4]。Williams等[5]发现在MS急性脱髓鞘病变区Sema3A的表达变化可能与轴突再髓鞘化有关。Hashimoto等[6]在研究大鼠脊髓半横断伤时，发现损伤区Sema3AmRNA量急剧下降，而对侧大脑皮层和同侧三叉神经核区则明显上升。表明中枢神经损伤早期，损伤的轴突和神经元胞体之间Sema3A表达存在梯度变化，据推测这种梯度变化可能有助于OPCs等神经前体细胞向损伤区迁移，有利于组织修复，但损伤3周后这种梯度变化开始消失。由此推测，损伤后期OPCs迁移减少，从而导致再生的轴突不能再鞘。因此认为，Sema3A在OPCs迁移和中枢神经损伤的修复中具有重要意义。

　　本研究成功构建了Sema3AFc真核表达载体,转染后表达的Sema3AFc融合蛋白经纯化、鉴定,分子质量正确,具有生物学活性，为进一步研究该分子在OPCs细胞迁移机制和中枢神经损伤修复奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1]Lepelletier Y,Smaniotto S,HadjSlimane R.Control of human thymocyte migration by Neuropilin1/Semaphorin3Amediated interactions[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(13):5545-5550.

　　[2]Eickholt BJ,Morrow R,Walsh FS,et al.Structural features of collapsin required for biological activity and distribution of binding sites in the developing chick[J].Mol Cell Neurosci,1997,9(5-6):358-371.

　　[3]马震宇,周迎会,陈永井,等.人4IgB7H3Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究[J].现代免疫学,2007,7(2):109-114.

　　[4]Spassky N,de Castro F,Le Bras B,et al.Directional guidance of oligodendroglial migration by class 3 semaphorins and netrin1[J].J Neurosci,2002,22(14):5992-6004.

　　[5]Williams A,Piaton G,Aigrot MS,et al.Semaphorin 3A and 3F: key players in myelin repair in multiple sclerosis[J].Brain,2007,30(10):2554-2565.

　　[6]Hashimoto M,Ino H,Koda M,et al.Regulation of semaphorin 3A expression in neurons of the rat spinal cord and cerebral cortex after transection injury[J].Acta Neuropathol(Berl),2004,7(3):250-256.