降钙素基因相关肽与内皮素受体A在兔实验性蛛网膜下腔出血后脑组织表达的对照研究

　　作者：宋锦宁， 张明， 梁琦， 郗磊， 王文博， 姜海涛    作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院神经外科， 陕西 西安 710061 　　【摘要】目的 探讨降钙素基因相关肽 （CGRP） 和内皮素受体A （ETRA） 在蛛网膜下腔出血 （SAH） 后脑组织中的表达情况及意义。 方法 日本大耳白家兔45只，随机分为SAH模型组 （20只），盐水对照组 （15只），穿刺对照组 （5只），空白对照组5只。采用枕大池2次注血法制作SAH的动物模型，并进行CGRP和ETRA的免疫组化染色，观察CGRP和ETRA的免疫表达。 结果 CGRP和ETRA免疫阳性标记在SAH组模型均有表达，CGRP阳性细胞在1 h时少量表达，3～7 d时表达明显，其中5 d时最显著，10 d时阳性细胞表达已经减少，但未达到正常水平。SAH模型组ETRA主要表达在神经元和胶质细胞胞浆内，建模后1 h时染色较淡；3 d时染色最强烈；5 d时染色较3 d弱，此后染色逐渐变淡。 结论 SAH后脑组织CGRP和ETRA的表达增强，并呈现明显的动态改变，但两者的变化趋势并不同步；CGRP和ETRA可能在延迟性神经功能障碍的发生与发展中起重要作用。

　　【关键词】  蛛网膜下腔出血 降钙素基因相关肽 受体 内皮素A

　　Expression of calcitonin gene-related peptide and endothelin receptor A in the brain tissue after experimental subarachnoid hemorrhage in rabbits: A case-control study

　　SONG Jinning, ZHANG Ming, LIANG Qi, et al.

　　Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Medical College, Xi'an Jiaotong University, Xi'an, 710061, China

　　Abstract:  Objective  To study the expression and the significance of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and endothelin receptor A (ETRA) in the brain tissue after subarachnoid hemorrhage (SAH).  Methods  Forty-five Japanese rabbits were randomly divided into four groups, including SAH-group (n = 20), saline-group (n = 15), puncture-group (n = 5) and blank-group (n = 5). The SAH animal model was established by autologus arterial blood injection into the cisterna magna twice. Immunohistochemical staining for GCRP and ETRA were used for observing their expression.  Results  Immuno-labeled granules of CGRP and ETRA were expressed in all 20 cases of SAH-group. The CGRP was expressed positively in few cells of SAH-group at 1 hour, strongly from 3 d to 7 d, especially at 5 d, and then the positive cells decreased at 10 d, but never came back to the normal. ETRA was expressed mainly in the cytoplasm of neurons and neuroglial cells in SAH-group. It was lightly stained at 1 hour after injecting the blood into cisterna magna at the first time, and then turned into dark brown at 3 d; it was stained lighter at 5 d than 3 d, and then become lighter gradually.  Conclusion  The expressions of CGRP and ETRA are obvious in the brain tissue after SAH, with a significant dynamic change, but their trends are not synchronous. CGRP and ETRA may play an important role in the development and progression of delayed neurological deficit.

　　Key words:  subarachnoid hemorrhage;  calcitonin gene-related peptide;  receptor, endothelin A        　　蛛网膜下腔出血 （subarachnoid hemorrhage，SAH） 后重要的病理生理变化之一就是延迟性神经功能障碍 （delayed neurological deficit，DND），但其确切的发病机制目前尚不清楚。本实验采用枕大池2次注血法制作兔SAH动物模型，对照观察降钙素基因相关肽 （calcitonin gene-related peptide，CGRP） 和内皮素受体A （endothelin receptor A，ETRA） 在脑组织中的表达及在整个SAH病程中的动态变化规律，现报告如下。

　　1    材料与方法

　　1.1    实验动物    日本大耳白家兔45只，雌雄不拘，健康状况良好，体质量2.1～2.9 kg，平均 （2.5 ± 0.4） kg。在相同条件及环境中饲养1周后进行实验 （购自西安交通大学实验动物中心）。

　　1.2    实验试剂及药品    CGRP一抗、兔抗兔ETRA单克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司；4%多聚甲醛灌注液购自西安交通大学医学院器材科。

　　1.3    实验分组    SAH模型组20只，盐水对照组15只，穿刺对照组5只，空白对照组5只。SAH模型组和盐水对照组根据建模后的不同时间段分为5个亚组：建模后1 h组、3 d组、5 d组、7 d组和10 d组，SAH模型组每个亚组4只，盐水对照组每个亚组3只。穿刺对照组和空白对照组分别行CGRP与ETRA免疫组织化学研究。

　　1.4    动物模型制作    采用枕大池2次注血法，间隔48 h制成兔SAH模型[1]：①用250 g/L乌拉坦经兔耳缘静脉注射麻醉，初次麻醉剂量为3 ml/kg，再次麻醉时剂量减为2 ml/kg。②动物麻醉后取俯卧位，在耳正中动脉用注射器抽取5 ml血液，血液抽出后轻微振荡防止其凝固。③兔颈部剃毛并固定四肢躯干，触摸到枕大孔边缘后作手术切口约2.5 cm，逐层钝性分离颈部肌肉至可触摸到枕大孔骨缘和第二颈椎棘突。用18 G套管针经环枕筋膜穿刺枕大池，为模拟真实SAH，尽量不放出脑脊液。④迅速将动脉血以0.5 ml/s的速度注入兔枕大池内，一般首次注血时以1.5 ml/kg的量注入，2次注血时以1 ml/kg的量注入。注血后迅速拔针，用纱布按压局部1 min，观察周围肌肉间隙内无渗血后将青霉素粉末撒在伤口局部，分层缝合肌肉和皮肤。⑤术毕以头低30°位放置以利血液分布在基底动脉周围。48 h后以同样方法进行第2次造模。盐水组对照动物模型的操作与SAH模型组相同，仅以等量的37 ℃生理盐水替代自体血。穿刺对照组仅分离枕部组织并行枕大池穿刺至脑脊液流出，48 h后进行第2次穿刺。空白对照组未行任何操作。

　　1.5    免疫组织化学标本取材    在对应时间点，用4%多聚甲醛固定液2 000 ml灌流固定。将基底动脉对应的延髓脑桥标本用石蜡固定，并制成5 μm切片，采用SABC法进行免疫组织化学染色并在光镜下进行观察。

　　1.6    统计方法    数据以均数 ± 标准差 （x ± s） 表示，运用SPSS 13.0统计软件进行方差分析 （ANOVA） 和t检验，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

　　2    结果

　　2.1    SAH模型的表现和大体观察    SAH模型组在造模后饮水、摄食、睡眠及体质量方面与对照组有显著差别，均出现精神淡漠、嗜睡、活动减少、饮水和进食减少，体质量较术前明显减轻。取脑观察：SAH模型组在建模后1 h可见广泛SAH，3 d组、5 d组、7 d组可见枕大池、基底池附近及基底动脉周围明显的凝血块，随时间的推移，凝血块的范围、大小和颜色渐减退，10 d组凝血块已经基本消失，仍可见少量SAH。

　　2.2    CGRP在延髓中的表达 （图1，表1）    穿刺对照组、盐水对照组在延髓中可见少量CGRP阳性细胞表达。SAH模型组在建模后1 h可见少量CGRP阳性细胞表达，在3～7 d组阳性细胞表达明显，其中5 d组最显著，有大量阳性细胞表达，10 d组阳性细胞表达已经减少。采用图像采集与分析系统取各组阳性细胞计数进行方差分析和t检验。经组间方差分析，盐水对照组、穿刺对照组与空白对照组的CGRP阳性细胞计数，无显著性差异 （P ＞0.05）；SAH模型组与盐水对照组阳性细胞数在各个时间点，均有显著性差异 （P ＜0.05）。

　　2.3    ETRA在延髓中的表达 （图2，表2）    SAH模型组脑组织ETRA主要表达在神经元和胶质细胞质内，建模后1 h染色较淡；3 d时呈深棕黄色，染色最明显；5 d时染色较3 d模型时弱，此后染色逐渐变淡。经方差分析和t检验：SAH模型组各亚组间差异有统计学意义 （P ＜0.05）。盐水对照组各亚组间差异无统计学意义（P ＞0.05）。穿刺对照组、空白对照组分别与盐水对照组各时间点比较，均无显著性差异 （均P ＞0.05）。SAH模型组与盐水对照组在各个时间点比较，具有显著性差异 （P ＜0.05）。

　　3    讨论        　　DND是导致SAH后病死率和致残率较高的重要原因之一，一般认为DND主要由脑血管痉挛引起的缺血所致。CGRP是由37个氨基酸组成的多肽，广泛存在于支配脑血管的神经末梢中，属于一种内源性舒血管神经肽，但在脑组织中亦有表达。研究表明[2]：CGRP免疫阳性细胞存在于皮质下中枢，以下丘脑和脑神经核含量最丰富。而且，CGRP阳性神经元在延髓和脑桥的网状结构标记较深。已有研究证明：CGRP具有以下生物学活性[3-6] ：①是目前已知最强的内源性舒血管活性物质；②不仅可抑制血管平滑肌细胞增殖，而且可促进内皮细胞增殖并改善其功能；③作为一种神经-免疫系统相互调节的介导物质之一，对多种免疫功能均有调节作用，同时也可调节T、B淋巴细胞的功能；④具有神经保护作用，在缺氧时抑制细胞外钙离子内流，降低细胞内钙离子浓度，减少细胞损伤。王玉梅等[7]研究表明，SAH后无论血液或脑脊液中CGRP 的浓度均逐渐降低，SAH后1 周降至最低，然后逐步回升。本实验观察到，SAH后CGRP在延髓中呈规律性表达：SAH后1 h已有表达，3～7 d呈逐渐升高趋势，在5～7 d时表达达到最高峰，从7 d时表达开始下降。比较各个时间段点延髓组织的 CGRP阳性细胞计数与相应延髓组织结构变化情况[8]，可以看出：延髓组织的CGRP阳性细胞在SAH后1 h已有表达，同时延髓组织结构也已发生变化，可看到神经纤维的断裂和神经胶质细胞的水肿等改变；延髓组织的CGRP阳性细胞在5～7 d时达到表达的最高峰，而延髓组织在5～7 d结构改变最明显，这二者的变化过程说明，CGRP与延髓组织的结构变化呈同步性动态改变，CGRP与DND的病理机制有关，SAH后脑组织CGRP的高度表达可能是神经系统对SAH后DND的一种重要的保护性反应。        　　内皮素是迄今为止发现的最强的血管收缩物[9]。ETRA可以激活调节细胞生存及增生信号通路中的各种激酶[10]。Zubkov等[11] 认为ET-1引起的浓度依赖性血管痉挛和MAPK免疫沉淀是由于激活了ETRA。虽然SAH后血液循环中会有很高浓度的ET-1，并且高浓度的ET-1可引起脑血管痉挛。但是神经功能的损害可能有更直接的因素，因为ETRA不仅是ET-1的受体，而且也可以介导并产生很多的生物学效应。沈伟等[12]发现CGRP 及内皮素在急性和迟发性CVS 中的作用不同。CGRP 对急性CVS 有一定的缓解作用，CGRP 的分泌下降及内皮素的过度分泌可能参与了迟发性CVS 的发生、发展。在本实验中，穿刺对照组、空白对照组动物脑组织中有少量ETRA表达；盐水对照组脑组织有个别细胞表达ETRA，对各时间点的ETRA阳性细胞计数进行方差分析，无显著性差异 （P ＞0.05）；对SAH模型组各时间点脑组织中神经元、胶质细胞ETRA表达阳性细胞计数进行方差分析，具有显著性差异 （P ＜0.05）；ETRA在SAH后1 h轻微升高，3 d后最高 （图2），5～10 d呈缓解下降的趋势。        　　综上所述：正常脑组织本身可有少量CGRP表达，很少或不表达ETRA，两者在正常生理状态下对神经功能无明显影响，但SAH后两者在脑组织中的表达发生了明显改变。本实验初步结果表明：①SAH后脑组织CGRP和ETRA的表达呈明显的动态改变， CGRP的表达在SAH后第5天最强，而ETRA的表达却在第3天时最强；②CGRP和ETRA表达的动态改变与动物神经功能障碍的表现在时间上是一致的，提示CGRP和ETRA可能在DND的发生、发展中起重要作用；③由于CGRP和ETRA在脑组织表达的变化趋势并不同步，说明SAH后DND的发生机制非常复杂，很可能是多种因素共同作用的结果。

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　　[11] ZUBKOV A Y, ROLLINS K S, PARENT A D, et al. Mechanism of endothelin-1-induced contraction in rabbit basilar artery [J]. Stroke, 2000, 31(2): 526-533.

　　[12] 沈伟, 余绍祖, 范华燕, 等. 降钙素基因相关肽及内皮素在实验性蛛网膜下腔出血后急性与迟发性脑血管痉挛中的作用 [J]. 临床神经病学杂, 2003, 16(4): 221-223.