nestin基因表达与胶质瘤恶性进展及预后相关性的初步研究
发表时间：2010-03-19 浏览次数：514次
作者：丁鹏，许亮，兰青，董军 作者单位：苏州大学附属第二医院神经外科， 江苏 苏州 215004 【摘要】 目的 研究神经干细胞标志物巢蛋白 （nestin） 基因在不同恶性程度人脑胶质瘤中的表达状况，分析其表达与临床病理及预后的相关性。 方法 采用实时荧光定量PCR方法检测80例人脑胶质瘤标本及4例正常脑组织中的nestin基因表达状况，并对其与临床病理及预后的相关性进行统计分析。 结果 在人脑胶质瘤组织中存在nestin基因表达，其表达水平与病理级别呈正相关 （r = 0.625，P ＜0.05），与病人生存时间呈负相关 （r = －0.312，P ＜0.05），而在不同性别、年龄及肿瘤部位中表达水平的差异无统计学意义 （P ＞0.05）。 结论 不同恶性程度胶质瘤中均可检出nestin基因表达，其表达水平与胶质瘤病理级别、病人生存时间之间存在显著关联，提示不同恶性程度胶质瘤中均存在胶质瘤干细胞，nestin表达水平可能与预后相关。
【关键词】 巢蛋白；逆转录聚合酶链反应；神经胶质瘤； 预后
Preliminary studies on relevance of nestin expression to malignancy progression and prognosis in gliomas
DING Peng, XU Liang, LAN Qing, et al.
Department of Neurosurgery, the 2nd Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou 215004, China
Abstract： Objective To evaluate the expression of nestin gene in human gliomas, and analyze its relationship with the pathological grades and prognosis. Methods The transcriptional levels of nestin in 80 glioma tissues and 4 normal brain tissues were measured by real-time fluorescence quantitative PCR, and the relevance of the nestin expression to the pathological grades and prognosis was further analyzed. Results The nestin expression was significantly up-regulated in different malignancy grades of glioma compared with normal adult brain tissues. Expression of nestin was also positively correlated with pathological grades(r = 0.625, P < 0.05), but negatively correlated with survival time (r = －0.312, P < 0.05). The age of patients, tumor grades and location of the tumor were not related with nestin expression (P > 0.05). Conclusion The nestin can be detected in all malignancy grades of gliomas. The expression of nestin, which is probably correlated with pathological grades and survival time, may be a potential prognostic factor with clinical significance.
Key words: nestin; reverse transcriptase polymerase chain reaction; glioma; prognosis
近年有关胶质瘤发生和恶性进展的分子机制和细胞起源研究取得了较大进展，一些学者提出了脑肿瘤干细胞 （brain tumor stem cell，BTSC） 理论[1-2]，为胶质瘤的研究提供了新的切入点。巢蛋白 （nestin） 是目前公认的神经干组细胞 （NSC）、肿瘤干细胞 （TSC） 及其前体细胞共表达的标志物[3]，在肿瘤细胞及反应性星形胶质细胞中表达。本研究采用荧光定量PCR技术检测nestin在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达情况，并分析其与胶质瘤病理分级及预后之间的关系。
1 材料与方法
1.1标本来源
收集2001~2007年80例经病理确诊并有完整临床及随访资料的胶质瘤手术标本，其中男50例，女30例。年龄16~72岁，平均44.1岁，≤40岁者36例，＞40岁者44例。根据WHO 2000标准分类，Ⅰ级16例，Ⅱ级27例，Ⅲ级21例，Ⅳ级16例。 所有标本离体后分成2份，1份立即置入液氮，以-80 ℃冻存备用。另1份行10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，苏木精-伊红 （HE） 染色后行病理诊断。另收集4例颅脑外伤行内减压手术切除的正常脑组织标本作为对照。所有肿瘤病人术前均未经其他针对性治疗。术后定期进行随访，时间3~36个月，生存时间从手术期开始计算，随访截止日期为2007年10月。随访期间已死亡者获完全数据，仍存活或死于非原发疾病或失去随访者获得删失数据。
1.2总RNA提取和cDNA合成
取50~100 mg新鲜组织样品，加入1 ml RNA抽提试剂Trizol （Invitrogen公司） 抽提总RNA，以紫外分光光度计测定A260及A280的吸光值，并计算RNA的浓度。取总RNA 2 μg按RevertAid first stand cDNA 合成试剂盒 （MBI Ferments公司） 说明书合成cDNA，-20 ℃保存备用。
1.3 nestin基因的检测
采用ABI荧光定量PCR仪以β-actin基因的表达作为内参。nestin引物序列由Primer primer引物设计软件设计、上海闪晶生物工程公司合成。nestin正向引物：5'-AGCCCAACGTACA CCCCGAT-3'；nestin反向引物5'-CCCCAGAACCC AACTCCTCC-3' （145 bp）。根据张弛宇等[4]介绍的方法制作标准曲线，进行相对定量分析。反应条件：94℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，共循环35次。每个标本均行复管检测，取均值做作为其表达水平。以同一份标本nestin拷贝数/β-actin拷贝数表示nestin基因的表达水平。
1.4统计学分析
实验数据经SPSS 13.0软件处理，采用Wilcoxon非参数检验分析各组基因表达差异。相关分析采用Spearman等级相关分析。以P ＜0.05为显著性差异水平。
2 结果
2.1 不同病理级别nestin基因表达状况 （图1）
80例胶质瘤标本中nestin mRNA平均表达水平显著性高于正常脑组织 （P ＜0.01），其表达水平随着病理级别的递增而升高；不同病理级别标本间的表达水平亦存在显著性差异 （P ＜0.05）。对nestin基因表达水平和病理级别进行Speraman等级相关分析显示：nestin基因的表达水平与肿瘤病理级别呈正相关 （r = 0.625，P ＜0.01）。
2.2 nestin基因表达水平与临床因素之间的关系 （表1） 对80例胶质瘤病人临床因素分析结果显示：不同性别、年龄和肿瘤部位的胶质瘤，nestin基因表达水平之间的差异无统计学意义 （P ＞0.05）；而对获得完全数据及随访满2年的53例病人进行统计分析显示：胶质瘤病人的生存时间随着nestin表达水平升高而下降 （r = －0.312，P ＜0.05；两组间放化疗情况差异无统计学意义）。
3 讨论 人脑胶质瘤的起源细胞尚无定论，最近的研究发现正常NSC可能发生致癌性基因突变转化为TSC，NSC可能通过对称分裂方式进行自我更新与增殖，而通过不对称分裂产生相对成熟的子代肿瘤细胞，这些子代细胞可以分化为更多成熟的细胞表型，即形成脑肿瘤。TSC的这种内在性质决定了肿瘤的瘤体大小、增殖速度、分化程度及浸润生长的特性，并通过不对称分裂方式导致脑肿瘤的发生[5-6]。 nestin是目前公认的NSC、BTSC及其前体细胞共表达的标志物，是主要在胚胎特定阶段表达的中间丝蛋白，而肿瘤细胞及反应性星形胶质细胞能再现其表达，因而nestin可被作为前体细胞的标志物或诊断低分化肿瘤的指标[7]。Strojnik等[8]对87例原发性胶质瘤标本进行免疫组化检测，其中95.8%的病人nestin表达阳性，且在不同病理级别中表达水平有显著性差异。本实验研究结果也表明：人脑胶质瘤中存在nestin基因的表达，nestin在mRNA水平的表达明显高于正常脑组织，在不同病理级别间其表达水平也存在着显著性差异，肿瘤恶性程度越高，其表达水平越高，两 者呈正相关 （r = 0.625，P ＜0.01）。不同生存期病人的nestin基因表达水平亦存在显著性差异 （P ＜0.05），存活时间≤2年者nestin平均表达水平为0.0623，而＞2年者为0.0501，提示nestin基因表达水平可作为判断病人预后的一项重要指标。这一结果也提示：神经胶质瘤中存在的恶性细胞可能与NSC、BTSC关系密切，NSC和BTSC可能在胶质瘤的发生、恶性进展中起重要作用。nesin基因表达水平在不同性别、年龄和部位的胶质瘤病人之间，差异无统计学意义 （P ＞0.05）。 当前，对胶质瘤的诊断与预后评估主要根据全体肿瘤细胞群的组织病理学和分子生物学特点为依据，这可能不能充分体现占较少比例的BTSC在肿瘤发生中所发挥的关键性作用。脑肿瘤中存在TSC的理论提示：尽管在许多肿瘤中存在着细胞异质性，但可能仅仅是一类细胞类型在肿瘤的产生和进展发挥了作用。因此，这一细胞类型的鉴定可能为肿瘤的监测和诊断提供了重要的标志物；且针对其进行适当的药物及分子生物学治疗可能是治疗中最关键、也最有效的方法[9]。 总之，本研究结果显示：人脑胶质瘤中NSC标志物nestin的表达水平与病理级别及预后关系密切，为进一步进行分子病理分类、判断预后和指导治疗等，奠定了基础。
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