食蟹猴脑出血骨髓间充质干细胞移植活体示踪观察

作者：冯铭    作者单位：中国医学科学院-中国协和医科大学北京协和医院神经外科， 北京 100730 　　【摘要】  目的 将超顺磁性氧化铁 （superparamagnetic Iron Oxide，SPIO） 标记人骨髓间充质干细胞 （human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC） 并植入脑出血食蟹猴脑内，利用MRI技术活体示踪移植的 hBMSC。 方法 将自体股动脉血注入食蟹猴右侧基底节区，制备脑出血模型。收集志愿者骨髓，分离培养hBMSC至第3代。脑出血模型制备后第7天，将5 × 106个SPIO标记的hBMSC通过立体定向手术移植入血肿对侧基底节区。移植后1 d、2周、4周、6周、8周采用MRI检查示踪hBMSC。食蟹猴处死后脑组织切片行苏木精-伊红及普鲁士蓝染色。 结果 SPIO标记hBMSC的效率大于96%，经SPIO标记的hBMSC移植后T2加权像可发现移植区呈明显的低信号区。苏木精-伊红、普鲁士蓝染色可发现移植细胞及新生血管分布于移植区周围，与MRI信号减低区一致。 结论 SPIO可有效地标记hBMSC，MRI可以活体示踪食蟹猴脑出血脑内移植的经SPIO标记的hBMSC。部分hBMSC可分化为血管，并促进宿主新生血管的形成。

　　【关键词】  间质干细胞移植 脑出血 成束猴 超顺磁性氧化铁

　　In vivo tracing bone marrow mesenchymal stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide in cerebral hemorrhage model of cynomolgus monkey

　　FENG Ming, ZHU Hua, ZHANG Nan, et al.

　　Department of Neurosurgery, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China;  Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China;  Department of Neurosurgery, Coal General Hospital, Beijing 100018, China

　　Abstract:  Objective  To explore the feasibility of in vivo tracking of bone marrow mesenchymal stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide (SPIO) by MRI in cynomolgus monkey as primate cerebral hemorrhage model.  Methods  The primate hemorrhage models were made by injection of autologous artery blood into the right basal ganglion area of the monkeys. Bone marrow of the volunteers was collected and human bone marrow stromal cells (hBMSCs) were separated and cultivated until the third passage. 5×106 hBMSCs labeled with SPIO were injected into the contralateral basal ganglion area of the monkeys after cerebral hemorrhage for 7 days. All the monkeys were examined by MRI to identify the hBMSCs at different time points (1 day, 2-week, 4-week, 6-week, 8-week). The brains were taken out to perform hematoxylin-eosin staining and Prussian blue staining.  Results  The labeling efficiency of hBMSCs with SPIO exceeded 96%. Hypointense signals were detected in the transplantation area. The transplanted cells and new vessels were identified and distributed in transplantation region where showed hypointense signals in MRI by Prussian blue staining and hematoxylin-eosin staining. SPIO can be found in blood vessel endothelium.  Conclusion  hBMSCs can be labeled with SPIO effectively and the transplanted hBMSCs can be tracked in cynomolgus monkeys after cerebral hemorrhage by MRI in vivo. Part of the transplanted hBMSCs may be differentiated into blood vessel endothelium and improve angiogenesis of the host brain.

　　Key words:  mesenchymal stem cell transplantation;  cerebral hemorrhage;  macaca fasciculari;  superparamagnetic iron oxide        　　人骨髓间充质干细胞 （human bone marrow mesen- chymal stem cells，hBMSC） 是一种具有自我更新、多向分化潜能的细胞，是神经组织损伤修复的种子细胞。磁共振技术可以活体示踪移植的hBMSC存活、迁移的情况。本研究将SPIO标记的hBMSC植入脑出血食蟹猴脑内，探讨MRI活体示踪hBMSC的可行性。

　　1    材料与方法

　　1.1    材料

　　1.1.1    实验试剂及仪器：    Feridex注射液 （Advanced Magnetics公司）、多聚赖氨酸溶液PLL （Sigma公司）、台盼蓝染液 （中国医科院基础所）、亚铁氰化钾 （广东西陇化工厂）、KOPF 1050型灵长类立体定向仪 （KOPF公司）、Philips Intera Achiva 3.0T磁共振机 （Philips公司）。

　　1.1.2    实验动物及饲养条件：    食蟹猴由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK （军） 2002-001，普通级。单笼饲养，温度18~28℃，相对湿度40%~70%，照明白 ∶ 夜为12 h ∶ 12 h。自由进食与饮水。

　　1.2    方法

　　1.2.1    细胞培养：    取正常成人骨髓20 ml，用淋巴细胞分离液 （密度1.077 g/ml） 梯度离心 （400 g，20 min），取白膜层单个核细胞，经过免疫磁珠纯化获得Flk1+、CD31-、CD34-的hBMSC，此细胞获国家食品药品监督管理局 （SFDA） 批准进行Ⅰ期临床研究，批件号：2004L 04792。计数细胞，置入DMEM/F12、MCDB-201、2%胎牛血清、10 ng/ml血小板生长因子、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml硫酸链霉素中培养，接种细胞浓度为1 × 106~2 × 106/ml。置37 ℃，5% CO2培养箱培养，3 d后换液，弃去非贴壁细胞，以后每3 d半量换液。当细胞达80%~90%融合时，用0.125%的胰酶常规消化传代，细胞传至第3代，消化收集并计数，以备移植用。

　　1.2.2    SPIO标记hBMSC及鉴定：    ①SPIO标记：Feridex （11.2 mg/ml） 44 μl，PLL （1.5 mg/ml） 10 μl，DMEM培养基10 ml，37 ℃振荡60 min，Feridex终浓度为50 μg/ml，与hBMSC 37 ℃、5% CO2共孵育过夜。②台盼蓝染色：1滴hBMSC悬液，2滴2%台盼蓝溶液，在细胞计数板静置2 min，显微镜下计数100个细胞，计算活细胞率。③普鲁士蓝染色：hBMSC悬液滴于载玻片、晾干，37%甲醛37 ℃水浴5 min，蒸馏水洗2遍，吸去多余水分，加 4%盐酸、4%亚铁氰化钾等比混合液，37 ℃水浴50 min。镜下观察，计数100个细胞，计算标记率。

　　1.2.3    食蟹猴脑出血模型的建立及SPIO标记的hBMSC脑内移植：    麻醉后将食蟹猴固定在KOPF立体定向仪上，顶部备皮，碘伏消毒，切皮，右顶颅骨钻孔1.5 cm × 1.0 cm大小，按立体定向图谱计算注射靶点在右侧壳核外侧，分3点注射，每点注血约0.5 ml后留针5 min，向上移动1 mm继续注射。注血结束后留针15 min。造模1周后，定位注射靶点于血肿对侧镜像区，将5 × 106个SPIO标记的hBMSC植入食蟹猴脑内。

　　1.3    磁共振扫描hBMSC活体示踪    Philips Intera Achiva 3.0T磁共振机扫描，8通道头部线圈，T1扫描序列为IR，视野：120 mm，TR/TE：2 153 ms/13 ms，层厚/间隔：3 mm/0.3 mm，矩阵：256 × 256；T2加权像扫描序列为SE，视野：12 cm × 12 cm，TR/TE：3 200 ms/ 102 ms，层厚/间距：3 mm/0.3 mm，矩阵：256 × 256。

　　1.4    组织病理学及普鲁士蓝染色    hBMSC移植2周后将1只食蟹猴过量麻醉，开胸，将灌洗针头通过左心室插入升主动脉，用1 500 ml生理盐水、1 000ml中性甲醛灌注后开颅取脑、修块、石蜡包埋、切片，常规苏木精-伊红染色及普鲁士蓝染色。

　　2    结果

　　2.1    细胞培养及鉴定    显微镜下hBMSC贴壁生长，为梭形、三角形、多边形，细胞核清晰可见，单个至多个核仁 （图1A）。

　　2.2    SPIO标记hBMSCs及鉴定    ①SPIO标记的细胞形态与未标记者无显著变化，细胞质内可见细小颗粒沉积，细胞表面不甚光滑，有较多细小颗粒物吸附，为Feridex，核仁清晰可见 （图1B）。②台盼蓝染色显微镜下死细胞被均匀染成蓝色，细胞体积较前增大，细胞外光晕消失。计数标记后活细胞率平均为98%。③普鲁士蓝染色显微镜下标记细胞呈蓝色，细胞内颗粒以核周及靠近胞膜处较明显，细胞间隙亦可见大量蓝色颗粒存在，细胞染色效率平均为96% （图1C、1D）。

　　2.3    磁共振扫描hBMSC活体示踪    MRI示右侧皮质下、壳核外侧可见片状血肿影，周围有水肿，血肿同侧侧脑室受压，中线向对侧移位，随着时间延长，T2WI信号按等信号-高信号-低信号演变。左侧壳核外侧移植区可见片状低信号区，为所移植的经SPIO标记的hBMSC。移植后随着时间延长，低信号区面积减小，信号强度增高 （经SPIO标记的hBMSC减少） （图2A、2B）。

　　2.4    组织病理学及普鲁士蓝染色    苏木精-伊红染色显示经SPIO标记的hBMSC为棕黄色，细胞核为蓝色，干细胞移植区域有大量的新生血管 （图2C）。普鲁士蓝染色可见hBMSC胞质中含有蓝色SPIO颗粒，箭头所指为新生血管 （图2D）。

　　3    讨论        　　干细胞活体示踪常用的方法有光学成像、核医学及MRI。其中MRI有效成像时间长，可观察细胞的动态迁徙过程，空间、时间分辨率高，对比度好，在干细胞活体示踪的应用前景较好。        　　临床上应用较多的SPIO是Advanced Magnetic公司生产的Feridex，美国食品及药物管理局 （FDA） 批准可进行临床应用。Feridex颗粒平均直径为80 nm，核心氧化铁直径为20 nm，外周为葡聚糖包裹，如Feridex、USPIO、Combidex、MION[1] ，可明显缩短 T2值，被称为T2对比剂。SPIO标记干细胞进行MR扫描有信号对比度好，尤其T2WI和T2*WI；对比剂由可生物降解铁组成，分解后重新被机体利用参与铁代谢；很容易用光镜或电镜观察到。但SPIO的铁颗粒会引起信号丢失，影响直接MRI相关解剖结构的显示；细胞所携带的非遗传物质会逐渐减少，被排出细胞外会被其他细胞所摄取。目前的研究在移植6周后可以检测到标记的细胞[2] ，本实验也证明了这一点。        　　单纯应用SPIO标记干细胞，最先由Frank等[3]采用，但标记效率较低。Frank等[3] 采用Feridex或MION- 46L分别标记hBMSC、鼠淋巴细胞、鼠少突前体细胞、人宫颈癌细胞。普鲁士蓝染色显示标记效率接近100%，但不使用转染介质时标记效率会很低。MRI显示经SPIO标记的细胞T2WI信号强度降低了50%~90%，但其增殖活性未受SPIO纳米颗粒的影响。我们前期实验也证实SPIO标记对hBMSC生物活性、增殖分化能力无有害影响。        　　磁共振追踪在中枢神经系统疾病模型中广泛应用。Hoehn等[4] 将小鼠胚胎干细胞植入缺血性脑卒中脑内，采用7T高解析度MRI观察，可见细胞沿胼胝体向损伤区域迁移。Zhang等[5] 将标记的神经前体细胞植入大鼠的小脑延髓池内，利用7T MRI可检测到细胞透过脑室系统到达缺血脑实质，标记细胞可分化成神经元并可改善神经损伤；认为急性缺血性脑卒中有明显的炎性反应，缺血组织可产生一种趋化因子吸引细胞向该区域迁移。Modo等[6] 研究表明，无论将干细胞植入卒中同侧还是对侧半球或脑室内，细胞均能迁移到病变部位。细胞产生这么大距离的迁移，可能与病变组织产生的化学趋化作用有关，将细胞吸引到病变周围从而产生作用。魏俊吉等[7] 将标记Ferumoxide的BMSC植入脑缺血大鼠的同侧及对侧脑实质内，MRI显示移植后第14天缺血同侧移植组BMSC向缺血灶边缘迁移，缺血对侧移植组BMSC沿胼胝体弥散。本实验脑组织切片普鲁士染色可见BMSC大量存活，移植区域有大量新生血管生成，因Flk1+ BMSC具有成血液、血管干细胞的特性，可以生成内皮细胞促进新生血管的形成[8]。移植后第6周MRI仍显示移植部位的低信号区，迁移距离不如文献报告明显，分析原因可能与移植细胞的种类、观察时间窗及动物大小有关。Guzman等[9]认为干细胞是否有迁移能力与移植部位及损伤区域的距离有关，认为距离不能超过1 mm，否则干细胞失去迁移能力。此外，脑出血模型造模对动物神经组织损伤不如脑缺血明显，是否不能产生足够的趋化因子吸引细胞迁移至损伤区域还有待进一步研究。        　　本实验证实Feridex可以高效地标记hBMSC，移植8周后MRI可在活体状态下观察到被标记的细胞，脑组织切片苏木精-伊红、普鲁士蓝染色证实MRI低信号区域有大量移植细胞存活，证明应用MRI活体示踪hBMSC是可行的。 

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　　[7] 魏俊吉, 王任直, 陆菁菁, 等. 超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑卒中的磁共振活体追踪 [J]. 中国医学科学院学报, 2007, 29(1): 73-77.

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