CD133基因表达与人脑胶质瘤恶性程度相关性分析

作者：许亮， 丁 鹏， *兰 青， 董 军    作者单位：苏州大学附属第二医院神经外科， 江苏 苏州 215004     【摘要】  目的 探讨人脑胶质瘤组织中胶质瘤干细胞标志物CD133的表达与肿瘤恶性程度的关系。 方法 应用实时荧光定量PCR方法检测75例不同病理级别胶质瘤组织及4例正常脑组织中CD133基因的表达情况，并与肿瘤病理级别进行相关性分析；同时采用免疫组化法检测35例肿瘤组织和2例正常脑组织中CD133的表达情况，在蛋白表达水平予以验证。 结果 CD133在基因转录水平和蛋白表达水平具有良好的相关性。CD133在正常脑组织中未见表达，在各级别胶质瘤中均有表达，且差异有显著性 （P ＜0.01）；CD133表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关 （P ＜0.01）。 结论 检测胶质瘤CD133表达水平有助于评价肿瘤的生物学行为，并为针对肿瘤干细胞的靶向治疗提供参考依据。

    【关键词】  神经胶质瘤； 肿瘤干细胞； CD133； 聚合酶链反应； 免疫组织化学

    Expression of CD133 gene in gliomas and its correlation with malignancy of the tumor

    XU Liang, DING Peng, LAN Qing, et al.

    Department of Neurosurgery, Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China

    Abstract：  Objective  To study the expression of CD133, a cell surface marker for glioma stem cells, in gliomas and its correlation with malignancy of the tumor.  Methods  quantitative real-time fluorescent PCR was used to detect the expression of CD133 gene in 75 glioma tissues and 4 normal tissues. The correlation between the expression levels and pathological grades of the tumors was analyzed. To confirm the real-time PCR data, CD133 protein expression of 35 tumors and 2 normal tissues was assessed by immunohistochemical analysis.  Results  Level of CD133 gene transcription and translation has good relevance. CD133 could be detected in glioma tissues, but not in normal brain tissues. There was a significant difference between the expression levels of CD133 and the malignancy grades of tumors (P ＜0.01), and there was a positive correlation between the expression levels of CD133 and the histological grading of tumors (P ＜0.01).  Conclusion  Detecting the expression level of CD133 will be helpful to evaluate the biological behaviors of gliomas and provide the reference for the target treatment of glioma stem cells.

    Key words:  glioma;  tumor stem cells;  CD133;  polymerase chain reactions;  immunohistochemistry        CD133 是相对分子质量为120 000的跨膜蛋白，被认为是迄今为止发现的胶质瘤干细胞最重要的标记物[1-3]。本实验应用实时荧光定量PCR方法检测CD133基因的表达情况，并与肿瘤病理级别进行相关性分析；同时采用免疫组化法检测CD133的表达情况，在蛋白表达水平予以验证。

    1    材料与方法

    1.1    材料来源    收集2005~2007年收治的75例经病理确诊的人脑胶质瘤手术标本，其中男48例，女27例；年龄16~71岁，平均44.5岁。肿瘤组织按胶质瘤分级标准 （WHO，2000）：Ⅰ级16例，Ⅱ级23例，Ⅲ级21例，Ⅳ级15例。术前均未接受化疗和放疗，术后予以标准化的联合治疗，并建立临床随访。同时收集4例脑外伤内减压手术所取正常脑组织 （额叶或颞叶） 标本作为对照。标本采集后均迅速置于液氮中，－70 ℃冻存备用；部分标本经10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。

    1.2    主要试剂和仪器    Trizol Reagent （Invitrogen），cDNA synthesis kit （Fermentas），羊抗人CD133多克隆抗体 （Santa cruz），EnVision试剂即用型 （HRP），FTC2000荧光定量PCR仪 （Canada）。

    1.3    组织总RNA抽提    取100 mg冻存组织，加入Trizol Reagent l ml；彻底匀浆后加入0.2 ml氯仿，颠倒混匀；离心后吸取上清，加入等体积异丙醇；离心沉淀后弃上清，75% 乙醇洗涤RNA沉淀；将RNA 溶解于DEPC水；分光光度计检测RNA含量和纯度，OD260/OD280需在1.8~2.0之间。

    1.4    cDNA合成    冰上操作，取总RNA样品5 μg，加入0.5 μg／ml Oligo（dT）18 引物1 ml，加DEPC-treated water 至12 ml，混匀并短暂离心；70 ℃ 加热5 min，冰上冷却并短暂离心；冰上操作，依次加入5 × reaction buffer 4 ml、Ribonuclease  inhibitor （20 U/ml） 1 μl、10 mmol／l dNTP mix 2 μl，混匀并离心，37 ℃反应5 min，加M-MuLV Reverse Transcriptase （200 U/ml） 1 μl，形成终体积20 μl；42 ℃反应60 min后，70 ℃ 加热10 min中止反应，冰上冷却。cDNA －20 ℃保存。

    1.5    实时定量PCR检测

    1.5.1    引物：    以β-actin基因的表达作为内参。CD133和β-actin基因引物序列由Primer 5.0引物设计软件设计、上海闪晶生物公司合成。引物序列如下：CD133正向：5'-TTCAGTGCTAGGAGGCGGA-3'；反向：5'-AGCTCTTCAAGGTGCTGTTCAT-3'；β-actin正向：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'；反向：5'-CTGGAAG GTGGACAGCGAGG-3'。

    1.5.2    荧光定量PCR反应：    PCR反应总体积为30 μl，内含cDNA模板1 μl，5 × PCR buffer 6 μl，Primers （25 pmol/μl） 0.6 μl × 2，SYBR Green Ⅰ 0.3 μl，dNTPs （10 mmol／l） 1 μl，Taq酶 （5 U/μl） 0.3 μl，Mg2+ （25 mmol／l）3 μl，DEPC水17.2 μl。荧光定量PCR扩增条件的设置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s、60 ℃ 25 s、72 ℃ 25 s，循环35次。

    1.5.3    质量的控制：    应用熔解曲线来监测基因的扩增，保证无引物二聚体生成；采集信号时，设定温度为80 ℃。对每个cDNA样本的每个基因均重复检测3次，在无明显差异的情况下，取平均值。当差异较大时 （2倍以上），则将样本重复检测5次，必要时重新实验。

    1.5.4    基因表达指数测定：    本实验使用相对定量法，以表达恒定的管家基因 （β-actin） 作为参照，来获得目的基因相对于参照基因的表达指数。依据文献方法[4]，随机选取待测样品的cDNA，经系列稀释后作为标准品，来构建相对定量标准曲线，获得斜率。根据斜率和相应样品的Ct值，获得目的基因的相对表达指数。

    1.6    免疫组化

    1.6.1    免疫组织化学染色：    随机取35例胶质瘤标本进行石蜡包埋。其中Ⅰ级6例，Ⅱ级12例，Ⅲ级10例，Ⅳ级7例。采用EnVision法进行免疫组织化学染色：每例石蜡标本以4 μm厚连续切片，58 ℃ 24 h；常规脱蜡至水，PBS洗3 × 3 min；用pH 6.0的0.01 mol/l CB热诱导修复 （微波3档、20 min），室温自然冷却，PBS洗3 × 3 min；0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min，室温；PBS洗3 × 3 min；20%正常羊血清室温孵育30 min，不洗；羊抗人CD133多克隆抗体 （1∶100稀释） 37 ℃孵育2 h；PBS洗3 × 3 min；EnVision试剂 （HRP-M） 37 ℃ 30 min；PBS洗3 × 3 min；DAB显色8~12 min；苏木素复染，热水蓝化；吹干后，树脂封片。PBS代替一抗做空白对照。

    1.6.2    免疫组化阳性结果判定：    CD133为跨膜蛋白，定位于细胞膜及细胞质。以细胞膜和细胞质出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。每张切片选取具有代表性的肿瘤区域，在高倍镜 （400 ×） 下随机选择l0个视野，计算出阳性细胞所占的百分率，作为CD133的标记指数 （labeling indes，LI），以LI ＞5%为阳性。

    1.7    统计学处理    采用SPSS 13.0统计软件进行分析，Kruskal-Wallis H检验分析不同病理级别胶质瘤组织的CD133基因表达差异是否具有统计学意义；Spearman等级相关分析法分析CD133表达情况与病理级别间的关系；Pearson相关分析法分析CD133在基因转录水平和蛋白表达水平的相关性。

    2    结    果

    2.1    荧光定量PCR    4例正常脑组织中均未检测到CD133基因表达。肿瘤组织均有CD133表达，且不同病理级别胶质瘤组织之间CD133基因表达差异显著 （P ＜0.01） （图1，表1）；Spearman相关性分析显示：肿瘤级别越高，CD133相对表达越多，两者呈正相关 （r = 0.850，P ＜0.01）。

    2.2    免疫组化    正常脑组织标本中未见CD133阳性表达，而肿瘤组织均可见CD133表达。各级别肿瘤组织中CD133阳性表达差异显著 （P ＜0.01）（表2）；Spearman相关性分析显示：CD133标记指数与病理级别呈正相关 （r = 0.848，P ＜0.01），在不同病理级别的胶质瘤组织中，CD133阳性表达随病理级别增高而增多 （图2）。

    2.3    荧光定量PCR与免疫组化结果相关性分析

    Pearson相关分析结果表明：CD133在基因转录水平和蛋白表达水平具有良好的相关性 （r = 0.822，P ＜0.01）。

    3    讨    论

    近年来发现：人脑胶质瘤中存在一种极少数的特殊细胞，即具备强大增殖潜能、自我更新和多向分化潜能的干细胞样肿瘤细胞，由此提出了胶质瘤干细胞 （glioma stem cells，GSC） 的概念，其为探讨胶质瘤的起源、发生、恶性进展、复发和放化疗耐受性等提供了重要的思路[5]。最早报道神经系统肿瘤干细胞的是Ignatova等[6]，他们将脑胶质瘤细胞在神经干细胞 （neural stem cells，NSC） 培养条件下进行培养，发现有细胞球形克隆形成，细胞中有NSC标记物表达，提示这类细胞具有与NSC相似的特性，因而将这类细胞称为肿瘤干细胞样细胞。Singh等[2]报告在NSC培养条件下从胶质瘤和髓母细胞瘤中分离出具有NSC特征的肿瘤细胞，并证实其为脑肿瘤干细胞 （brain tumor srem cells，BTSC）。Strojnik等[7]使用免疫组化法评估87例不同病理级别原发性脑胶质瘤标本中干细胞标志物nestin、musashi的表达情况，结果表明：胶质瘤病人中95.8%存在nestin表达、80%存在musashi表达，且胶质瘤病理高级别组与低级别组中的nestin表达情况有显著性差异。本实验利用实时荧光定量PCR方法，证实了各级别胶质瘤组织中均有CD133阳性表达，且不同级别肿瘤中的表达差异存在显著性，恶性程度越高的肿瘤中，CD133的表达越高，两者呈正相关；本实验同时采用免疫组化法进一步验证了荧光定量PCR的实验结果，表明CD133在基因转录水平与蛋白表达水平一致，与肿瘤恶性程度呈正相关。

    本研究检测到正常脑组织中CD133表达呈阴性，分析原因，可能与本研究所取正常脑组织来自成人额、颞叶，NSC含量极低难以检测，CD133无表达或极低表达而未能检测到有关。在各级别胶质瘤组织中均有CD133表达，证明胶质瘤组织中确实存在一定数量具有干细胞特征的细胞，即GSC。Singh等[8]认为干细胞是肿瘤的起源细胞，它们是肿瘤组织中分化最差的一类细胞，这些细胞可能通过对称分裂方式进行自我更新与增殖，而通过不对称分裂产生相对成熟的子代肿瘤细胞，后者可以分化为更多成熟的细胞表型，即形成脑肿瘤。这两种分裂方式使肿瘤组织中的肿瘤干细胞 （tumor stem cells，TSC） 和子代细胞的数量增加，导致肿瘤生长。随着TSC的分化，其子代细胞丧失增殖能力。TSC的这种内在性质决定了肿瘤的瘤体大小、增殖速度、分化程度及浸润性生长的特性[9]。

    本研究发现：胶质瘤恶性程度越高，CD133的表达越高，说明瘤体内GSC比例更高，因而具有更高的自我更新与增殖能力，其产生的TSC及子代细胞数量越多，肿瘤增殖能力越强，肿瘤生长速度越快。这与胶质瘤的临床表现及病理学特征相符。

    近几十年来，尽管在肿瘤细胞生物学和分子生物学研究方面取得了长足的进展，但胶质瘤病人的临床预后并无实质性改善，其重要原因是胶质瘤的细胞学起源仍然未知[10]。因此，长期以来，胶质瘤的病因和起源一直是神经外科领域研究的热点问题，存在多种假说和争议，至今仍无明确的结论。GSC的发现为胶质瘤的起源提供了新的思路，目前认为，GSC可能来源于NSC或神经前体细胞，也可能来源于发生基因突变的肿瘤祖细胞或分化障碍的肿瘤细胞[11]。这一理论将对胶质瘤的诊断和治疗产生深远的影响。目前，胶质瘤的诊断和预后主要依赖于组织病理学特点。然而由于肿瘤的异质性，单纯依靠组织病理存在着很大的局限性。GSC的发现可能会改变这一现状，虽然GSC只占肿瘤细胞的一小部分，但是它通过自我更新和分化之间的平衡维持着肿瘤的生长，因此，分析GSC可以对胶质瘤有一个最为基本的评价。结合本研究的结果，检测胶质瘤CD133表达水平有助于评价肿瘤的生物学行为，可以通过检测胶质瘤中CD133的表达情况，来评估GSC在胶质瘤中的比例，从而探讨其与肿瘤恶性程度的关系，为诊断和预后判断提供帮助；同时，本研究也为针对GSC的靶向治疗提供了重要的参考依据，从肿瘤治疗角度来看，针对GSC产生致命性效应的治疗措施才能从根本上改善胶质瘤的治疗效果[12]。本研究下一步将结合CD133及其他可能与胶质瘤预后有关的基因表达情况和临床参数 （年龄、病理级别、复发状态等） 一起，统计分析各因素与病人的预后关系，建立一个多变量的胶质瘤预后模型，将更具临床意义。

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