Bex2对人脑胶质瘤干细胞增殖、生长和凋亡影响的体外实验研究
发表时间:2010-03-12 浏览次数:524次
作者:于如同 作者单位:徐州医学院附属医院神经外科 【摘要】 目的 观察Bex2真核表达载体对脑胶质瘤干细胞增殖、生长和凋亡的影响,为胶质瘤治疗提供理论基础。 方法 采用免疫磁珠系统分离、Nestin免疫组化鉴定人脑胶质瘤干细胞;将RT-PCR法获得的Bex2与质粒pcDNA3.1(+) 连接,脂质体法转染胶质瘤干细胞,于转染18 h、36 h、48 h、72 h、96 h后,采用Western Blot检测Bex2表达,MTT法及Hoechst染色试剂盒检测生长抑制率和凋亡情况。 结果 分离、培养出人脑胶质瘤干细胞,并成功构建Bex2的真核表达载体。转染后18 h Bex2即有表达,48 h达到高峰,后渐下降;转染36 h、48 h、72 h、96 h时,细胞生长抑制率和凋亡率明显高于空载体组和空白对照组 (P <0.05);转染72 h时,细胞生长抑制率和凋亡率最高 (P <0.05)。 结论 Bex2能够抑制脑胶质瘤干细胞的增殖和生长,诱导胶质瘤干细胞凋亡。
【关键词】 Bex2基因 真核表达载体 胶质瘤干细胞 细胞凋亡
Effects of Bex2 gene on multiplication, growth and apoptosis of human brain glioma stem cells in vitro
YU Rutong, LIU Mingfeng, SHI Qiong, et al.
Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China; Graduated Faculty, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China
Abstract: Objective To study effects of Bex2 on multiplication, growth and apoptosis in human glioma stem cells and provide rationale for gene therapy of glioblastoma. Methods Human brain glioma stem cells were isolated and indentified by using the magnetic activated cells sorting (MACS) and nestin immunohistochemistry. The cDNA of Bex2 was amplified by RT-PCR, and then Bex2 ligated to plasmid pcDNA3.1(+). The recombinant was transfected into human glioma stem cells. On 18, 36, 48, 72 and 96 h after transfection, the expression of Bex2 was observed by Western blotting. Cell inhibition ratio was detected by MTT. Growth inhibition rate and apoptosis profile of the cells were assayed by Hoechst 33258 staining. Results Human brain glioma stem cells were isolated and cultured, and recombinant of Bex2-pcDNA3.1(+) constructed successfully. After transfection, Bex2 began to express at 18 h, reached its peak at 48 h and then decreased gradually. MTT assay manifested that growth inhibition rate of Bex2 group at 72 h was higher than those at other time points (P < 0.05). Moreover, growth inhibition rates of Bex2 group at 36, 48, 72, 96 h were obviously higher than those of the vector and control groups (P < 0.05). The results of Hoechst 33258 assay were coincident with those by MTT. Conclusion Bex2 gene can inhibit proliferation and growth of brain tumor stem cells, and induce their apoptosis.
Key words: Bex2 gene; eukaryotic expression vector; glioma stem cell; apoptosis 研究表明:抑瘤基因的后天性沉寂是导致肿瘤发生的重要因素,而Bex2在所有脑肿瘤标本中均表现为基因后天性沉寂。本研究拟采用基因克隆及基因重组技术构建基因Bex2-pcDNA3.1(+) 真核表达载体,转染脑胶质瘤干细胞,观察细胞的生长、增殖及凋亡情况,为进一步研究Bex2及其他后天性沉寂基因对脑肿瘤细胞分化增殖的影响提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料 脑胶质瘤组织取自徐州医学院附属医院神经外科手术室,由徐州医学院中心实验室进行细胞培养。大肠杆菌JM101由徐州医学院生化教研室惠赠。柱式Trizol总RNA抽提试剂盒 (上海生工);LipofectamineTM 2000、pcDNA3.1(+) 为Invitrogen公司产品;氨苄青霉素、矿物油购自Sigma公司; Bex2 Anti-body为incompara公司产品,引物由上海生工生物工程有限公司合成。DMEM/F12 (1∶1) 培养基B27和N2添加剂 (Gibco/B RL);碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF) 均为Sigma公司产品;CD133+细胞分选试剂盒为Miltenyi Biotech公司产品;噻唑蓝 (MTT) 检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;Hoechst染色试剂盒购自江苏碧云天公司;其他常用试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 Bex2真核载体的构建: 取颅脑手术病人的脑胶质组织,迅速投入液氮中冻存,提取总RNA,采用RT-PCR扩增Bex2 cDNA,回收Bex2 cDNA片段,与T载体连接,转化后制备质粒DNA,进行HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定和测序鉴定。将鉴定正确的重组体经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切,回收的目的基因由T4 DNA连接酶连接于经相同内切酶双酶切的pcDNA3.1 (+) 表达载体,制备Bex2-pcDNA3.1 (+) 重组体,纯化后-20 ℃保存备用。
1.2.2 细胞培养: 采用我室方法[1]分离、培养胶质瘤干细胞,巢蛋白 (Nestin) 免疫组化鉴定。培养成功后将部分细胞放入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 和10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中,常规方法液氮冻存,备用。
1.2.3 脂质体法转染胶质瘤干细胞: 实验随机分为实验组、空载体组、空白对照组。以上各组均在培养瓶中悬浮培养,每瓶接种细胞数约为5×105个。将Bex2重组质粒和脂质体分别稀释于无血清DMEM/F12培养基中,混匀,静置5 min后将质粒与脂质体混合,室温放置20 min,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱孵育,20 min后将质粒与脂质体的混合物加到无血清DMEM/F12培养基、密度为80%的胶质瘤干细胞培养瓶中 (DNA ∶ 脂质体 = 1 ∶ 3)。分别于18 h、36 h、48 h、72 h、96 h时,收集细胞,进行检测。
1.2.4 Western Blot检测目的基因的表达: 提取总蛋白并检测,计算蛋白浓度。取样品45 μl上样于10% SDS-PAGE胶进行垂直电泳 (电泳条件:开始恒压为100 V,样品进入分离胶后调整为200 V),蛋白Marker定位。电泳结束后转至NC膜,封闭,分别加入一抗、二抗,于NBT/BCIP显色液中显色。水洗终止反应。
1.2.5 MTT法检测细胞生长抑制率: 收集细胞,分于96孔板,1 × 104细胞/孔。每孔中各加入180 μl DMEM培养液,再加入20 μl MTT,离心收集细胞,每孔加入200 μl DMSO,低速振荡10 min。在酶联免疫检测仪550 nm处测量各孔的吸光值A。抑制率 = (A对照-A测定)/A对照 × 100%。
1.2.6 Hoechst染色试剂盒检测细胞凋亡: 离心收集细胞样品,加入0.5 ml固定液,固定37 ℃、10 min,去固定液,用PBS洗2遍,3 min/次。离心后吸去大部分液体,保留约50 μl 液体,滴加至载玻片上。均匀滴上0.5 ml Hoechst 33258染色液,染色5 min,滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,以380 nm入射光激发,455 nm观察并拍照。
1.2.7 数据统计学分析: 数据以均数 ± 标准差表示。统计分析采用单因素方差分析 (ANOVA),多个实验组与1个对照组比较采用最小显著性差异 (LSD) 法,实验组之间比较采用q检验 (Newman-keuls test);P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功构建Bex2真核载体 测序结果显示所克隆的Bex2序列与GeneBank的Bex2序列完全一致,说明Bex2的387个碱基均无突变。Bex2-pcDNA3.1 (+) 重组体经HindⅢ/EcoRⅠ 双酶切,1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子,显示2条DNA片段,一条分子量大小与pcDNA3.1 (+) 碱基数相符,约为5.4 kb,另一条约387 bp,与Bex2碱基数一致,提示Bex2与pcDNA3.1 (+) 形成重组体 (图1)。
2.2 成功分离、培养胶质瘤干细胞 采用免疫磁珠分选法分离出CD133+细胞,分离后的CD133+细胞、CD133-细胞分别在无血清培养基中培养,CD133+细胞再次形成细胞球能力很强,而CD133-细胞则丧失了增殖能力。Nestin免疫组化证实培养好的CD133+细胞即为所需的肿瘤干细胞。
2.3 Western Blot结果 (图2) 在Bex2真核表达载体转染胶质瘤干细胞18 h后,Bex2即有表达,48 h达到高峰。
2.4 细胞生长抑制率 Bex2真核表达载体转染胶质瘤干细胞18 h时,细胞的增殖无明显变化;而在36 h、48 h、72 h、96 h,实验组的细胞增殖受到抑制,细胞生长抑制率分别为8.39 ± 0.01、14.8 ± 0.88、21.9 ± 0.69、18.46 ± 0.98,高于空白组、空载体组 (P <0.05)。结果表明:基因Bex2对肿瘤干细胞的增殖产生了抑制作用,至72 h时达到最高 (图3)。
2.5 Hoechst染色试剂盒检测 正常细胞圆而大,呈低蓝色;而凋亡细胞呈高蓝色。18 h时镜下偶见凋亡细胞,36 h、48 h、72 h、96 h实验组细胞凋亡增加,细胞凋亡率分别为9.49 ± 2.30、16.18 ± 1.45、23.9 ± 1.44、14.54 ± 1.34,高于同时间段的空白组、空载体组 (P <0.05)。结果表明:Bex2可以抑制胶质瘤干细胞增殖,诱导细胞凋亡且在72 h时达到高峰 (图 4)。
3 讨论 最新研究发现:脑肿瘤中存在着具有自我更新并不断增殖的细胞亚群,即脑肿瘤干细胞 (brain tumor stem cell,BTSC)。BTSC是引发肿瘤并维持脑肿瘤生长和复发的细胞来源,在肿瘤的发生过程中起着决定性的作用。而CD133迄今为止被认为是BTSC最重要的标记物[2-4]。本实验从脑胶质瘤手术标本中分离出CD133+细胞和CD133-细胞,分别在无血清培养基中培养,发现CD133+细胞再次形成细胞球能力很强,而CD133-细胞则丧失了增殖能力,证明CD133+细胞在胶质瘤增殖和复发中起着决定性的作用。 Bex2作为Bex基因家族的成员之一,具有Bex结构域 (domain)、神经营养因子相关的细胞死亡执行蛋白 (NT-associated cell death executor,NADE) 结合位点及额外的酪氨酸蛋白激酶Ⅱ (CK-Ⅱ) 磷酸化位点、N-糖基化位点,在中枢神经系统的发育中具有特殊的调控作用,因而在中枢神经系统中呈高水平表达。 Foltz等[5]发现:Bex2在脑肿瘤标本中表现为基因后天性沉寂,表明该基因在肿瘤生长、增殖过程中被抑制。当应用TSA、5-Azac等解除基因抑制的药物,使Bex2在U87、T98等脑胶质瘤株中重新表达时发现,Bex2对胶质瘤细胞的生长、增殖分化产生抑制作用,表明Bex2可能在调控恶性胶质瘤细胞凋亡的信号通路上扮演重要角色。但他们仅对U87、T98等脑胶质瘤细胞株进行了研究,而本研究则首先构建人Bex2-pcDNA3.1(+) 真核表达载体,转染人脑胶质瘤干细胞,观察细胞的生长、增殖及凋亡情况;结果显示:Bex2真核表达载体转染胶质瘤干细胞18 h时即有少量表达,48 h后表达量最高,约为空白组与空载体实验组的3倍;此外,MTT和Hoechst 33258染色结果表明:胶质瘤干细胞的生长、增殖得到了抑制,细胞凋亡增加。转染后36 h、48 h、72 h和96 h,抑制率与正常对照组及空载体对照组比较,差异有统计学意义 (P <0.05);提示Bex2可对脑胶质瘤干细胞的增殖、生长、分化等产生抑制,并促进细胞凋亡。其生长抑制率和凋亡率在72 h达高峰,然后下降;其可能原因是基因导入一定时间后失去效用,导致Bex2表达下降。 Foltz在实验中采用的5-Azac、TSA为启动子超甲基化和组蛋白去乙酰化抑制剂,其抑制作用缺乏特异性,因为DNA甲基化和组蛋白去乙酰化是一种正常的基因调控方式,它们在抑制异常甲基化和组蛋白去乙酰化的同时,也可引起处于抑制状态的某些基因恢复活性,导致正常的基因调控机制发生紊乱,因此,其在实际应用中受到限制。本实验为后天性沉寂的抑瘤基因的重新表达提供了一个新的思路,即在体外使用基因克隆及基因重组技术将后天性沉寂的抑瘤基因扩增,然后应用载体导入肿瘤干细胞,从而对肿瘤的生长、增殖产生抑制,并促进细胞凋亡。但目前仍存在问题,即本实验中的脑胶质瘤干细胞是分离鉴定纯化的,细胞密度高,有利于Bex2导入发挥作用;所用的真核载体对肿瘤不具有特异性;且导入后发挥效用的持续时间也是Bex2基因在实际应用中的难点。最新的研究显示:神经干细胞 (neural stem cells,NSC) 作为未分化的原始细胞,不表达成熟细胞抗原 (如主要组织兼容性复合物Ⅰ类或Ⅱ类抗原)[6],呈低免疫原性,具有自我更新和多潜能分化能力,及向胶质瘤细胞迁徙的趋向性[7-8]。因此,以后我们将构建Bex2基因过表达的NSC作为载体,进行进一步的研究。 总之,本实验结果表明:Bex2可以对胶质瘤干细胞的生长、增殖产生抑制作用。这为脑胶质瘤的基因治疗提供了新的思路和方法,将促使更多的后天性沉寂基因被发现并应用于肿瘤的治疗中。
【参考文献】 [1] 于如同, 饶海承, 石琼, 等. 靶向Survivin和FoxM1B的shRNA对人脑胶质瘤干细胞生长和凋亡的影响 [J]. 中华实验外科杂志, 2008, 25(1): 107-110.
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