大鼠脑挫裂伤半暗带水肿与血-脑屏障破坏的关系

大鼠脑挫裂伤半暗带水肿与血-脑屏障破坏的关系作者：丁胜超， 金永成， 林贵军， 高 峰， 李 欢， 刘佰运    作者单位：北京大学航天临床医学院神经外科， 北京 100049    【摘要】  目的 研究大鼠局灶性脑挫裂伤半暗带的水肿变化与血-脑屏障 （BBB） 破坏的关系。 方法 将126只雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组、挫裂伤组和给药组，采用Feeney法制作脑挫裂伤模型，给药组采用曲克芦丁脑蛋白水解物合剂腹腔给药，分别用伊文思蓝 （EB） 染色法和干湿法观察BBB的变化和脑组织的水肿情况，同时电镜观察超微结构。 结果 EB染色显示：挫裂伤组和给药组在伤后1 h EB开始漏出，6 h最严重。水含量测定结果显示：挫裂伤组和给药组伤后6 h水含量开始增加，72 h增至高峰。与挫裂伤组比较，给药组脑组织EB溢出量、水含量降低 （P ＜0. 05）。 结论 大鼠脑挫裂伤半暗带BBB通透性改变早于脑水肿的发生，提示BBB破坏可能是早期创伤性脑水肿的结构基础。曲克芦丁脑蛋白水解物合剂可通过改善BBB等多种途径治疗脑挫裂伤。    【关键词】  脑损伤； 脑水肿； 血脑屏障； 曲克芦丁； 蛋白水解产物    Relationship of edema and blood-brain barrier disruption in the penumbra area  after rat focal brain contusion  DING Shengchao, JIN Yongcheng, LIN Guijun, et al.  Deptartment of Neurosurgery, the Aerospace Clinical College, Beijing University, Beijing 100049, China    Abstract:  Objective  To investigate the relationship of edema and blood-brain barrier (BBB) disruption in the penumbra area of rat focal brain contusion.  Methods  One hundred and twenty-six male SD rats were randomly divided into 3 groups: sham-operation group, contusion group and medication administration group. Brain contusion model was established using Feeney's method. In the medication administration group, the rats were injected intraperitoneally with troxerutin-brain protein hydrolysate mixture. Blood-brain barrier permeability and brain edema were evaluated by Evans blue extravasation and dry-wet weight method, and ultrastructure was observed under electromicroscope.  Results  In the contusion and medication administration groups, Evans blue extravasation was observed 1 h after trauma, peaked at the 6th hour. In the two groups, the brain water content increased from 6 h after trauma, and peaked at 72 h. Compared with the contusion group, the quantity of Evans blue extravasation and brain water content were lower in the medication administration group (P ＜0.05).  Conclusion  After brain contusion, the change in BBB permeability is earlier than brain edema, which suggests that BBB disruption may be the base of early traumatic brain edema. Troxerutin-brain protein hydrolysate mixture is able to inhibit the occurrence and development of traumatic brain edema via improving the blood-brain barrier.    Key words:  brain injuries;  brain edema;  blood-brain barrier;  troxerutin;  protein hydrolysates            创伤性脑损伤 （Traumatic Brain Injury，TBI） 可导致继发性损伤，最常见的是创伤性脑水肿。本实验通过测定脑组织伊文思蓝 （EB） 含量、水含量及观察超微结构的变化，初步研究半暗带区水肿和血-脑屏障 （BBB） 的关系，同时采用曲克芦丁脑蛋白水解物合剂进行干预治疗，并探讨可能的作用机制。1    材料与方法    1.1    材料与设备    EB、甲酰胺、多聚甲醛、磷酸二氢钠购自北京化学试剂公司。Philips EM208S透射电镜、Strone90高速牙钻、烤箱、7230G 分光光度仪、电子天平、普通开颅手术器械、自由落体脑损伤装置由北京市神经外科研究所提供。    1.2    动物分组    SD雄性大鼠126只，体质量 （250 ± 20） g，由北京市神经外科研究所动物室提供，随机分为3组：假手术组、挫裂伤组、给药组 （曲克芦丁脑蛋白水解物合剂2.5 ml·kg－1·d－1，腹腔内注射），后两组再分为伤后 1 h、6 h、24 h、72 h及7 d 5个时间点。假手术组6只，挫裂伤组及给药组每个时间点12只。    1.3    脑挫裂伤模型的制作    采用Feeney等[1]的模型，自制自由落体脑损伤装置，10%水合氯醛按4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，用牙科钻在右侧大脑中线旁2 mm钻孔，直径5 mm，避免损伤硬脑膜，20 g砝码从30 cm高度打击，造成右顶叶局灶性脑挫裂伤，致伤冲量为600 g·cm。缝合头皮，置鼠笼喂养。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不致损伤。    1.4    脑组织水含量测定    采用干湿重法。在各时间点处死动物，取出大脑，滤纸吸尽脑表面血渍，锐性分离伤侧顶叶皮质约100 mg，取下称湿重 （WW），110 ℃恒温电烤箱内，烤24 h至恒重 （两次称重差别≤0.2 mg），称取干重 （DW）。含水量= （WW－DW）/WW × 100%。    1.5    BBB的观察    EB测定BBB的通透性。术前1 h静脉注射2% EB 3ml/kg，术后灌注生理盐水200 ml，直至右心房流出清亮液体，迅速断头，按照MR 扫描层面切成层厚2 mm的脑切片，拍照观察损伤灶蓝染情况。取损伤侧半球脑组织称湿重后，放入盛有4 倍体积甲酰胺的离心管中，盖上盖子，45℃水浴24 h，1 500 r/min 离心10 min，取上清液，用7230G 分光光度仪在EB 最大吸收光谱635 nm处测量吸光度，在绘制的标准曲线上查得EB含量。    1.6    光镜观察病理改变    麻醉动物成功后断头处死，迅速取脑组织放入4%多聚甲醛缓冲液中 （pH = 7），4℃固定24 h，石蜡包埋。按Pellegrion大鼠脑冠状图谱，由额极至枕极间隔2 mm连续切片，切片厚5 μm，苏木精－伊红染色。显微镜下观察组织学改变。    1.7    电镜观察组织超微结构    大鼠麻醉后，打开胸腔，经左心室穿刺升主动脉快速灌注生理盐水200 ml，剪开右心耳，随后在30 min内灌注4℃、25%戊二醛及20%多聚甲醛磷酸盐缓冲液200 ml，断头经枕骨大孔开颅，取出脑组织，取材于顶叶损伤周边5 mm组织，大小约1 mm3，置入2%多聚甲醛及2.5%戊二醛中于4℃固定2 h，二甲砷酸钠缓冲液 （pH 7.2） 冲洗3次后用1%锇酸固定，经酒精脱水，环氧丙烷置换，树脂包埋，先行天青美蓝染色，光学显微镜定位后，再行醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色，用Philips EM208S电镜行透射电镜观察，摄片。    1.8    统计学处理    采用SPSS 13.0分析软件处理数据，各项指标以均数 ± 标准差 （x ± s） 表示，均数比较采用单因素方差分析，各组间差异采用独立样本t 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。2    结    果    2.1    脑组织水含量 （表1）    脑挫裂伤后1 h，各组脑组织水含量均未见明显升高，挫裂伤组与假手术组及给药组比较，差异无统计学意义 （P ＞0.05）；伤后6 h开始升高，72 h达到高峰，7 d时仍处于较高水平，挫裂伤组与假手术组及给药组比较，差异均有统计学意义 （P ＜0.05）。挫裂伤组与给药组同时间点比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。    2.2    BBB观察 （表2）    挫裂伤组伤后1 h可见EB渗出 （图1A），6 h达最高峰 （图1B），对侧也出现EB蓝染，24 h仍有大量渗出，72 h、7 d时渗出明显减少。给药组波动规律类似挫裂伤组。但挫裂伤组与给药组同时间点比较，差异有统计学意义 （P ＜0.05）。    2.3    组织学观察    2.3.1    光镜：    苏木精－伊红染色显示挫裂伤组在不同时间点出现不同损伤情况，早期可见损伤中心血管腔内大量红细胞聚集，毛细血管内皮细胞肿胀，神经元大量破坏，后期可见损伤中心为无结构的坏死区，在损伤周围可见固缩的神经元，毛细血管周围大量红细胞聚集，血管周围淡染。    2.3.2    电镜：    损伤后1 h，挫裂伤神经元及星形胶质细胞变性程度较轻，神经元内线粒体稍肿胀，内质网、核糖体改变不明显，核膜轻度凹陷。星形胶质细胞肿胀，空泡变性，内质网轻度扩张，大多数神经元肿胀 （图2A）；6 h可见凋亡现象，BBB破坏加重，内皮细胞、周皮细胞以及星形细胞足突肿胀明显，毛细血管受压，管腔开始逐渐消失 （图2B）；24 h可见神经元固缩，神经毡空泡变性；72 h及7 d可见凋亡细胞，内含凋亡小体。    给药组1 h后改变类似挫裂伤组，6 h后BBB内皮细胞及毛细血管星形细胞足突肿胀，破坏较轻，可见基本正常BBB及神经元 （图2C），也可见血管周围巨大水肿空泡，核糖体解聚，核膜解聚，周边空泡变性 （图2D），神经元及胶质细胞空泡变性。24 h稍恢复，但仍可见凋亡细胞。3    讨    论    TBI中最常见的原发损伤是脑挫裂伤，脑挫裂伤后24 h损伤范围将扩大到原损伤范围的30%~300%[2]，脑挫裂伤的发展变化主要在挫裂伤周围，即“创伤半暗带”[3]，近年国内外均有相关研究，Stoffel等[4]采用微透析技术研究创伤半暗带区的兴奋氨基酸释放及缺血造成的迟发性神经元损伤，结果表明：兴奋性氨基酸受体拮抗剂可能有效。临床上应用离散加权像 （DWI） 和灌注加权像 （PWI） 来确定脑梗死半暗带区，已得到认可；刘佰运等[5]研究发现：在猫脑挫裂伤周围DWI和PWI的不匹配区，即传统认为的半暗带区，第1次从影像学并结合超微结构证实了“创伤半暗带”的存在。    创伤半暗带区是挫裂伤后继发损伤的重要部分，它比单纯脑梗死半暗带要复杂，涉及众多影响因素，如缺血、坏死组织、水肿、BBB开放及细胞凋亡等。本实验对挫裂伤半暗带区水肿与BBB破坏的关系进行了初步研究。创伤性脑水肿是外伤后常见的病理反应，常引起颅内压增高而导致预后不良，国际上将脑水肿分为4类：渗透压性、血管源性、细胞毒性和脑积水性，临床上多为混合性脑水肿。其发生机制复杂，至今仍未得到完全阐明，目前的学说主要有BBB开放、Ca2+超载、氧自由基毒性作用、微循环障碍等[6]。    Baskaya等[7]在脑冲击伤模型中发现，伤后4~6 h和3 d，EB渗出明显增加，提示BBB可能存在2次开放，而水含量高峰出现在伤后24 h，提示两者的出现存在不同步现象。李书林等[8]在大鼠脑液压冲击伤模型中发现：伤后1 h、4 h，伤侧EB含量均明显高于对照组，且对侧脑组织EB含量与伤前比较也高于伤前假手术组。Habgood等[9]系统回顾了脑外伤后BBB变化，发现脑损伤后BBB很快开放，大分子 （蛋白质大小） 和小分子 （286~10 000 u） 均可通过BBB进入周边脑组织，4~5 h后大分子被阻滞，而小分子仍可通透直至伤后4 d。本实验中我们发现：伤后1 h即可见EB渗出，提示BBB已经开放，伤后6 h渗出最明显，是开放高峰，但并未见2次开放；水含量在1 h时无明显变化，6 h含量增加，72 h增至高峰，较文献研究延迟48 h，可能是因为模型制作方法存在差异，或时间点划分不同等。对比两者可发现，EB渗出早于水含量的变化，说明BBB开放和脑水肿的发生存在不同步现象，由此我们推测水肿的发生可能是由于BBB损伤，导致一系列后续事件，如Ca2+超载、氧自由基毒性作用等。因此，如能早期干预，减轻BBB损伤，从源头上阻止上述事件的发生，进而减轻水肿的发生，可能会带来更好的预后。    TBI后继发损伤十分严重，治疗困难。曲克芦丁脑蛋白水解物合剂是曲克芦丁 （维脑路通） 和脑蛋白水解物混合注射液，两者具有协同作用，可作用于血管和神经双靶位。曲克芦丁是维脑路通的主要成分，具有改善微循环，对抗5-羟色胺、缓激肽引起的血管损伤，防止血管通透性增加及避免BBB开放引起的脑水肿的作用；另一成分脑蛋白水解物的主要成分是小分子多肽及多种氨基酸，可提供神经递质、肽类激素和辅酶的前体物质，易透过BBB，直接进入神经细胞，影响细胞呼吸链，调节神经递质，激活腺苷酸环化酶参与细胞内蛋白质合成，具有类似神经生长因子的作用，有利于神经组织修复和神经功能改善。两者合用可避免单用一种药物的缺陷，具有治疗与营养神经的双重效应。本实验采用曲克芦丁脑蛋白水解物合剂对创伤性颅脑损伤进行治疗，与挫裂伤组比较，发现可有效防治BBB的破坏，减轻脑水肿，保护神经元及胶质细胞，减轻神经元微环境的破坏。【参考文献】[1] FEENEY D M, BOYESON M G, LINN R T, et al. 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