蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病大鼠模型行为学退行性改变的研究
发表时间：2010-02-24 浏览次数：521次
蛋白酶体抑制剂诱导帕金森病大鼠模型行为学退行性改变的研究作者：梅加明 作者单位：安徽医科大学附属省立医院神经外科 安徽省立体定向神经外科研究所， 安徽 合肥 230001 【摘要】 目的 观察蛋白酶体抑制剂诱导的帕金森病 （PD） 行为学退行性变化，探索其发病机制。 方法 将32只大鼠随机分成实验组和对照组，每组16只，将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射到实验组大鼠左侧黑质致密部，对照组注射等体积生理盐水。术后1、3、5、7、9、11、14、18和21 d，追踪观察大鼠自主行为和阿扑吗啡诱导的旋转行为变化；开野实验观察大鼠自发运动行为改变。 结果 实验组给药后，随着时间推移大鼠开始出现渐进性自发性活动减少、动作缓慢、对外界刺激不自主竖毛、震颤；阿扑吗啡诱导的向健侧旋转运动逐渐增多。开野实验结果显示：实验组大鼠自发运动行为出现渐进性异常改变。 结论 蛋白酶体抑制剂Lactacystin单侧黑质致密部微量注射诱导的大鼠行为学呈渐进性发展，符合PD发病过程，说明蛋白酶体功能下降可能在PD发病机制起重要作用。 【关键词】 帕金森病 蛋白酶抑制药 模型 动物 Retrograde changes of motor behavior in the rat models of Parkinson disease induced by Lactacystin MEI Jiaming, NIU Chaoshi, CHEN Jianmin, et al. Department of Neurosurgery, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medial University, Anhui Provincial Institute of Stereotactic Neurosurgery, Hefei 230001, China Abstract: Objective To observe the retrograde changes of motor behavior in Parkinson disease (PD) induced by proteasome inhibitors, and investigate its pathogenesis. Methods Thirty-two rats were equally randomized into two groups: lactacystin group and control group. Lactacystin, a selective proteasome inhibitor, was injected stereotaxically into the left substantia nigral pars compacta (SNc) in experimental rats. Equal volume of saline was injected into the control rats. At different stages (1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 18 and 21 d after injection), the spontaneous behavioral abnormalities were observed. The changes in the contralateral rotations induced by apomorphine and the spontaneous behavior in the rats in the open-field tests were tracked. Results Compared with the control group, the rats in the lactacystin group began gradually to have some behavioral symptoms, for example, the spontaneous motors decreased progressively, tardive dyskinesia, piloerection, tremor, contralateral rotations induced by apomorphine increased gradually. Simultaneously, the retrogression of behavior in open-field tests was observed. Conclusion Lactacystin unilaterally injected stereotaxically into SNc of rats could induce time-dependent retrograde changes of behavior in rats after proteasome inhibition, which is just in accord with Parkinson symptoms, indicating that proteasome dysfunction may play a significant role in the pathogenesis of PD. Key words: Parkinson disease; protease inhibitors; models, animal 本实验采用立体定向技术将蛋白酶体抑制剂Lactacystin注射到大鼠黑质致密部，在不同时间段以不同方法观察大鼠的行为学变化，以便了解帕金森病 （PD） 模型与自然临床发病进程是否相吻合，探讨蛋白酶体抑制在PD发病机制中的作用。1 材料与方法 1.1 实验材料 健康Sprague Dawley （SD） 大鼠32只，体质量为200～250 g，由安徽医科大学动物实验中心提供；Lactacystin、阿扑吗啡 （APO，美国Sigma公司）。大鼠立体定向仪 （SR-6N型，日本NARISHIGE公司）、笔式小型磨钻 （韩国世新精密公司）、10 μl微量注射器和开野实验箱。 1.2 动物分组与干预 将32只SD大鼠随机分为实验组和生理盐水对照组，每组16只，经反复行为检测确认其无旋转行为且健康后开始进行实验。3.5%水合氯醛 （350 mg/kg） 腹腔麻醉，大鼠固定在立体定向仪上，齿杆较耳杆低2.4 mm，根据 《大鼠脑立体定向图谱》[1]，确定左侧黑质致密部为前囟后5.2 mm，矢状缝左侧2.2 mm，硬膜下7.2 mm；切开颅部皮肤，钻开颅骨 （勿损伤及硬脑膜），定向注射10 μg Lactacystin （2 μg生理盐水溶解），缓慢进针，注射速度为0.5 μl/min，留针5 min，缓慢退针，缝合切口。对照组注射等体积生理盐水。 1.3 动物行为的观察及APO诱导旋转实验 注射Lactacystin后1、3、5、7、9、11、14、18和21 d观察大鼠的行为改变，是否出现震颤、活动迟缓、抓握、嗅探、穿梭距离等异常行为，同时腹腔注射APO （0.5 mg/kg），观察大鼠旋转行为的改变，并记录30 min的大鼠旋转圈数。 1.4 开野实验[2-3] （open-field test） 注射Lactacystin后1、3、5、7、9、11、14、18和21 d分别行开野实验检测。开野实验箱：黑色敞口木箱，大小为60 cm × 60 cm × 40 cm，箱底划为25个方格 （12 cm × 12 cm），将大鼠放入正中一格，10 s后开始记录15 min内各项行为指标。反映运动活跃性的指标：①总跑动时间：大鼠躯干处于水平位置时向前后或两侧运动的时间；②总停息时间：大鼠不表现任何活动的时间 （无头或肢体运动及理毛行为）；③下肢站立次数：双前肢抬起离地1 cm以上的次数；④穿梭距离：规定时间内跑动的格子数 （2爪以上跨入邻格为跑动1格）；⑤反映不对称运动行为的指标：大鼠自发向左侧或右侧行1/4弧度的环形活动次数；⑥下肢站立时左侧或右侧前肢倚靠箱壁的次数。⑦嗅觉实验，大鼠靠近箱壁进行探究活动 （鼻子距离箱壁5 cm以内） 的次数。实验在17∶00～22∶00进行，实验室内暗光、安静，2次实验之间将箱底打扫干净。 1.5 统计学分析 实验数据采用均数±标准差表示,使用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析。两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK法，不符合参数检验应用条件的数据采用非参数检验，以P ≤0.05为差异具有统计学意义。2 结 果 2.1 动物一般行为及诱导旋转行为变化 实验组注药后，逐渐出现自发性活动减少，运动缓慢，静止性震颤和对外界刺激不自主竖毛，开始不明显，随着时间推移，症状逐步加重，至18 d症状显著。APO诱导向健侧旋转，表现为以健侧后肢为支点，头尾相接，身体弯曲成环状快速旋转。给药后不同时期30 min的旋转次数逐渐增多 （图1），而对照组未观察到明显的行为改变，且APO未能诱导出旋转行为。 在单侧注射Lactacystin后，经APO诱导向健侧旋转的次数开始很少，随着时间延长越来越多，并且在第7天开始明显增多，直到14 d增加变缓，18 d旋转次数已达到 （213.8 ± 11.2） r/30 min，21 d旋转次数达到 （264.7 ± 9.3） r/30 min。 2.2 开野实验 2.2.1 反映活跃性指标实验 （表1）： 实验组大鼠随着时间延长，跑动减少、变得缓慢，穿梭距离逐渐下降，而对照组大鼠跑动活跃，近1/3的时间都在跑动。实验组大鼠四肢开始出现震颤，下肢站立次数逐渐下降，而对照组大鼠站立次数依然很多。实验组大鼠逐渐出现呆滞状态，运动迟钝，总停息时间亦在逐渐延长，而对照组未观察此现象。 2.2.2 反映不对称运动行为的实验 （图2）： 对照组大鼠跑动时向左或向右转次数的差异无统计学意义。实验组大鼠表现出跑动时显著倾向于左转行为，向左的1/4弧度环形旋转次数明显多于向右侧的次数。 对照组大鼠后肢站立时用左前肢或右前肢倚靠箱壁的次数几乎相同，两者的差别无统计学意义。实验组大鼠后肢站立时更倾向于用左前肢倚靠箱壁，注药后短期内差别不明显，但随着时间延长左前肢倚靠箱壁的次数明显多于右前肢，到21 d，两者差异有统计学意义 （图3）。 2.2.3 嗅觉测试实验 （图4）： 实验组大鼠的探究次数随着时间延长逐渐减少，且活动范围窄，偶尔触嗅一下即停止；对照组大鼠探究活动活跃、灵敏，且是沿着箱壁进行，还不时更改探究的方向和部位。3 讨 论 泛素蛋白酶体体系 （UPS） 在真核细胞中担负着80%的多胞内蛋白的降解，UPS介导的蛋白水解作用参与细胞分裂周期的调节，细胞转录维护，抗原加工，血管发生，错误折叠或损伤蛋白的清除等，对维持细胞正常的生命活动起着极其重要的作用。 最近，Sun等[4]报道了MG-132 （一种蛋白酶体抑制剂） 在大鼠中脑原代细胞和大鼠模型中可引起选择性多巴胺能神经元退变，与McNaught等[5]用Lactacystin对胎鼠中脑原代细胞进行研究的结果一致，这些实验均显示蛋白酶体功能下降会导致一系列黑质致密部病理变化的发生。在此病理学基础上，本实验对大鼠行为学进行了研究，显示PD模型大鼠的行为学变化是渐进发生的，具有时间相关性，符合PD的临床发病过程。 APO诱导旋转实验，反映了大鼠脑内左右侧黑质-纹状体多巴胺 （DA） 通路功能的不对称，随着时间延长，大鼠的旋转次数逐渐增多，18 d时旋转次数达到213.8 r/30 min，达到合格PD动物模型的诱发旋转圈数＞7 r/min或210 r/30min的标准[6]。同时开野实验数据也显示：随着时间延长，大鼠的自发性活动出现进行性减少。随着实验时间延长，大鼠不对称行为出现如下改变：①大鼠跑动时向左的1/4弧度环形旋转次数明显多于向右侧的次数，在注药后21 d时的差异具有统计学意义。②大鼠后肢站立时左前肢倚靠箱壁的次数明显多于右前肢，且21 d时的差异具有统计学意义。另外，嗅觉障碍被誉为PD的首要症状[7]，开野实验发现，实验组大鼠刚开始时探究活跃，与对照组无区别，但随着时间延长探究次数逐渐减少，且活动范围变窄，偶尔触嗅一下即停止，远不如对照组探究神情活跃，范围较大。这些行为学变化恰好符合PD渐进性发病、缓慢性进展的病程。 总之，蛋白酶抑制剂诱导的大鼠行为学变化呈退行性变化，且这种渐进性退变与PD起病隐匿、缓慢进展的特征相一致。由此可见，蛋白酶体功能下降可能在PD发病机制中起着极其重要的作用，为PD发病机制及药物干预的研究开创了新局面。至于行为学与病理学之间的关联性，如DA神经元的减少与α-synuclein蓄积的增多是否与行为学退行性变化有关，及Lewy小体 （PD病理标志） 如何影响PD病人的嗅觉通路等，有待于进一步研究。【参考文献】[1] 包新民, 舒斯云. 大鼠脑立体定向图谱 [M]. 北京: 人民卫生出版社, 1991: 48-54.[2] FORNAGUERA J, SCHWARTING R K. Early behavio- ral changes after nigro-striatal system damage can serve as predictors of striatal dopamine depletion [J]. Prog Neu- ropsychopharmacol Biol Psychiatry, 1999, 23(8): 1353- 1368.[3] REGLODI D, LUBICS A, TAMAS A, et al. Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide protects dopamin- ergic neurons and improves behavioral deficits in a rat model of Parkinson's disease [J]. Behav Brain Res, 2004, 151(1-2): 303-312.[4] SUN F, ANANTHARAM V, ZHANG D, et al. Proteasome inhibitor MG-132 induces dopaminergic degeneration in cell culture and animal models [J]. Neurotoxicology, 2006, 27(5): 807-815.[5] MCNAUGHT K S, MYTILINEOU C, JNOBAPTISTE R, et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system causes dopaminergic cell death and inclusion body formation in ventral mesencephlic cultures [J]. J Neuro Chem, 2002, 81(2): 301-306.[6] 牛朝诗, 傅先明. 帕金森病常用动物模型制作及其进展 [J]. 中华神经医学杂志, 2005, 4(5): 521-524,527. [7] HUMMEL T, JAHNKE U, SOMMER U, et al. Olfactory function in patients with idiopathic Parkinson's disease: effects of deep brain stimulation in the subthalamic nucleus [J]. J Neural Transm, 2005, 112(5): 669-676.
