染料木黄酮对C6胶质瘤细胞抑制作用的实验研究

染料木黄酮对C6胶质瘤细胞抑制作用的实验研究作者：杨小放 王世波 韩静    作者单位：063300河北省唐山市丰南区医院神经外科杨小放；天津环湖医院神经外科王世波，神经放射科韩静 【摘要】  目的 通过观察染料木黄酮(genistein)抑制并诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用，探讨其对于胶质瘤治疗的可行性。方法 采用MTT法、Hoechst33258荧光染色、流式细胞术和透射电镜方法，观察染料木黄酮抑制并诱导C6细胞凋亡作用。结果 MTT法测得染料木黄酮对C6胶质瘤细胞的IC50值为18 μg/ml，浓度为5～70 μg/ml的染料木黄酮具有抑制C6胶质瘤细胞作用，且细胞抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而增加；流式细胞术、荧光染色以及电镜证实诱导凋亡及死亡是染料木黄酮抑制C6胶质瘤细胞的主要方式。结论 异黄酮类化合物染料木黄酮具有诱导C6细胞凋亡和死亡的作用。提示染料木黄酮可以直接通过诱导C6胶质瘤细胞凋亡和死亡而发挥抗肿瘤作用。 【关键词】  胶质瘤 染料木黄酮 细胞凋亡  Effects of genistein on growth inhibition and cytotoxicity of C6 cell YANG Xiao-fang,WANG Shi-bo,HAN Jing. Department of Neurosurgery, Fengnan district hospital,063300 Tangshan,China.  Abstract: Objective To investigate the growth inhibition and apoptosis induction effects on rat C6 glioma cell by genistein in vitro. Methods The growth inhibition and apoptosis induction effects of genistein on C6 cell were observed by MTT, Hoechst33258 fluorescence, flow Cytometry, transmission electronmicroscope and agarose gel electrophoresis. Results The IC50 of genistein to C6 cell was 18 μg/ml, genistein at 5～70 μg/ml inhibited growth of C6 cell. Hoechst33258 fluorescence, flow Cytometry, transmission electronmicroscope confirmed both apoptosis and death of C6 cell were induced by genistein. Conclusions Genistein can induce death and apoptosis of C6 cell; it may be a promising glioma inhibitory agent by direct induction of cell death and apoptosis.  Key word: glioma; genistein; apoptosis  大豆提取物染料木黄酮(genistein)属异黄酮类化合物，它广泛存在于包括大豆在内的多种蔬菜和水果中，其化学名为4,5,7 三羟基异黄酮，具有弱雌激素作用，是非特异性酪氨酸蛋白激酶抑制剂。已有的体外研究发现，染料木黄酮能显著抑制人白血病、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、卵巢癌和垂体瘤等肿瘤细胞系生长，诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本研究通过将染料木黄酮作用于C6胶质瘤细胞系，了解染料木黄酮在体外抑制胶质瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡的可能，为其临床应用治疗胶质瘤提供理论依据。1 材料与方法  1.1 材料 染料木黄酮购于北京百威昂医药技术开发公司，批号GT20040220，色谱纯度98.2%，DMEM培养基、胎牛血清和二甲亚砜（DMSO）购于美国Gibco公司，大鼠C6胶质瘤细胞系由本室保存。  1.2 仪器 Bio Rad 450酶标仪，Ultima Insight激光共聚焦显微镜，HITACHI600透射电镜，Calibur流式细胞仪。  1.3 方法  1.3.1 细胞培养及药物配制 将C6胶质瘤细胞置入DMEM高糖培养液中，加入10%小牛血清，于37℃、5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次，0.25%胰酶消化，实验时取对数生长期细胞，分为处理组(染料木黄酮+DMSO)、溶剂（DMSO）对照组和空白对照组。染料木黄酮溶于DMSO，储备液浓度20mg/ml，实验中DMSO终浓度控制在0.1%以内。  1.3.2 MTT法测定染料木黄酮对C6细胞的IC50值 MTT溶于磷酸盐缓冲液，实验当日配制，浓度2 mg/ml，过滤除菌；调整细胞浓度至1×105/每孔，接种96孔板。分别加入不同浓度的染料木黄酮，终浓度分别为5、10、15、20、25、30、40、50、60、70 μg/ml，另设空白对照和培养基对照，每个浓度重复8孔，细胞培养72 ｈ，倾去培养基，加入MTT50 μl，37℃，5%CO2培养箱中孵育4h，加入DMSO100 μl震荡5分钟，酶标仪570 nm比色，计算各组细胞的抑制率，抑制率%=(空白对照组OD值-实验组OD值)/(空白对照组OD值-培养基对照组OD值)，作图法得出IC50。  1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 对数生长期的C6细胞接种于50 ml培养瓶，细胞80%融合时，加入终浓度为20 μg/ml染料木黄酮，培养24、48和72 h，0.25%胰酶消化收获细胞。取上述各时段细胞悬液100 μl，先加入10 μl AnnexinⅤ-FITC室温避光染色10 min，再加入5 μl PI染色10 min，流式细胞仪检测分析细胞凋亡及死亡变化。每次计数10 000个细胞，用Modfitlt软件分析。  1.3.4 Hoechst33258荧光染色 C6细胞接种于12孔板，分为空白对照组、DMSO对照组和实验组，于37℃、5% CO2培养箱中培养至70%～80%融合，加入染料木黄酮，使终浓度为20 μg/ml后继续培养。于加药后24、48和72 h，倾弃上清，加入不完全培养基洗涤两次后，直接滴加Hoechst33258染液1ml，避光染色10 min，PBS清洗两次，激光共聚焦显微镜下观察照相。  1.3.5 电镜观察细胞凋亡 C6细胞经染料木黄酮20 μg/ml处理72 h，胰酶消化，磷酸缓冲液洗涤，细胞经2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，己醇脱水，树脂包埋，超薄切片,铀铅双重染色，透射电镜下观察拍照。2 结 果  2.1 染料木黄酮对于C6细胞的生长抑制作用  相同细胞培养条件，药物作用时间均为72 ｈ，不同浓度染料木黄酮对细胞生长抑制率如图1所示。由作图法得出染料木黄酮对C6细胞的IC50值约为18 μg/ml，确定以浓度20 μg/ml染料木黄酮为最佳干预剂量，见图1。  图1 染料木黄酮抑制C6细胞生存曲线2.2 流式细胞术检测结果 浓度20 μg/ml染料木黄酮作用于C6细胞24 h、48 h和72h后，细胞的早期凋亡率分别为14.12%、21.49%和26.30%，明显高于空白对照组3.74%和DMSO对照组2.37%的自然凋亡率，且细胞死亡率亦呈增高趋势5.73%到13.21%，见图2。  图2 流式细胞术检测20 μg/ml染料木黄酮作用不同时间后C6细胞凋亡  2.3 Hoechst33258荧光染色结果 激光共聚焦显微镜下，20 μg/ml木黄酮作用24、48、72 h引起C6细胞形态学改变。处理组大量细胞核均呈现不同程度蓝色荧光着色，凋亡细胞的细胞核或细胞质内可见到2或2个以上浓染致密的颗粒块状蓝色荧光，为核浓集。空白对照组和DMSO组细胞形态无改变，细胞核基本未被蓝色荧光着色，形态正常，偶尔可见少量着色细胞，为自发凋亡细胞，见图3。  图3 Hoechst33258荧光染色观察结果C6 细胞凋亡2.4 透射电镜检测结果 电镜下对照组C6细胞大小不等，外形不规则，核大，圆形、椭圆形，常染色质丰富。20 μg/ml染料木黄酮干预72 h后可见细胞间连接消失，细胞体积缩小，胞浆凝缩，内质网变疏松并与胞膜融合，形成空泡样变，核糖体和线粒体等细胞器聚集。细胞核内的染色质逐渐凝聚成新月状或者分块状，附在核膜周边。部分细胞核固缩成均一的致密物，或者断裂成碎块，细胞膜多保持完整。可见部分有膜包裹糖原、脂滴及少量核物质的小体(凋亡小体)，以上变化符合典型的细胞凋亡的形态学特征，见图4。3 讨 论  胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤，也是治疗的难点。近年，一些研究发现以染料木黄酮为代表的异黄酮类化合物可以抑制神经系统恶性肿瘤生长、抑制肿瘤细胞因子合成和降低其侵袭性等多种抗肿瘤作用［1，2］。Khoshyomn S等采用染料木黄酮联合BCNU作用于体外培养的人类胶质母细胞瘤U87和大鼠C6胶质瘤细胞，发现染料木黄酮在4 μmol/L的浓度下，可以显著增强BCNU的肿瘤抑制作用，比单纯BCNU作用提高30%～41%，且联合应用染料木黄酮可以提高化疗药物作用，减少使用其剂量，减轻其毒性。同时，在对3种髓母细胞瘤细胞株的研究中，也得到类似的结果，说明染料木黄酮具有显著的协同化疗作用［3,4］。本研究采用多种常规的细胞凋亡检测方法均观察到单独应用染料木黄酮对于体外C6胶质瘤细胞具有凋亡诱导作用，这种作用具有剂量依赖性和时间依赖性；高浓度和长时间作用，细胞的凋亡增加。在观察到细胞凋亡的同时，流式细胞术还发现相当数量细胞发生死亡，也呈现时间依赖性（10.91%，13.88%和18.43%），提示染料木黄酮本身还可能对C6细胞具有直接的细胞杀伤作用。  目前已经有数种黄酮类化合物制剂用于包括乳腺癌、前列腺癌等的临床治疗试验。早期学者认为，染料木素因具有雌激素样作用而对雌激素依赖性肿瘤有抑制作用，原因为染料木素与雌激素同时作用于靶器官，竞争结合雌激素受体，可减轻雌激素的促细胞增殖作用，降低与雌激素有关的肿瘤的发病危险。近来的研究表明，染料木素对非雌激素依赖性肿瘤也有一定程度的抑制作用，作用机理较为复杂，对不同种类肿瘤的作用不一致,这可能与染料木黄酮多种抑瘤途径有关。已发现染料木黄酮抑制肿瘤的机制包括：抗氧化作用、抑制酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)活性、抑制拓朴异构酶活性、诱发细胞凋亡、提高抗癌药效、抑制血管生成等作用，抑制肿瘤细胞周期和协同化疗作用［5～7］。对于染料木黄酮抑制C6胶质瘤细胞的机制，作者考虑可能与其抑制Ca2+离子通道，阻止酪氨酸蛋白磷酸化，阻断EGF、VEGF等细胞因子的合成，影响细胞周期以及有丝分裂有关，确切的机制需要进一步研究。染料木黄酮等黄酮类化合物对于胶质瘤作用的体外研究已经取得了初步的效果，并且向体内研究发展［8］。体外实验观察到染料木黄酮具有较理想的胶质瘤细胞抑制作用，在体内能否达到同样效果是作者以后研究要解决的问题。黄酮类化合物本身的脂溶性决定其良好的血脑屏障透过，理论上适合用于中枢神经系统肿瘤的治疗［9］。深入研究染料木黄酮对于在体模型胶质瘤的作用，将促进其早期应用于临床治疗。【参考文献】［1］ Kandaswami C, Perkins E, Drzewiecki G, et al. 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