高频电刺激伏隔核对吗啡诱导大鼠条件性位置偏爱行为的影响

作者：倪伟刚， 周晓平， 胡小吾， 姜秀峰， 曹依群    作者单位：中国人民解放军第二军医大学附属长海医院神经外科， 上海 200433

【摘要】  目的 研究高频电刺激伏隔核 （nucleus accumbens，NAc） 对吗啡诱导戒断大鼠觅药行为的影响，分析NAc在大鼠成瘾行为中的作用。 方法 26只雄性SD大鼠通过吗啡强化形成条件性位置偏爱后，13只予以120 Hz高频电刺激伏隔核 （吗啡刺激组），另13只予以假刺激 （吗啡假刺激组）。15 d后给予注射吗啡，诱导大鼠恢复位置偏爱行为，测量并比较两组的位置偏爱得分。 结果 吗啡电刺激组大鼠在注射吗啡诱导下不易恢复对吗啡的条件性位置偏爱，位置偏爱得分为 （237.59 ± 79.89） s，吗啡假刺激组为 （441.29 ± 212.68） s，两组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01）。 结论 电刺激NAc能阻断注射吗啡诱导戒断大鼠恢复觅药行为。在成瘾药物诱导戒断动物觅药行为的过程中，NAc起重要作用。

【关键词】  吗啡 伏隔核 电刺激 条件性位置偏爱

　　 Influence of high frequency electrical stimulus to the nucleus accumbens on morphine reduced conditioned place preference in rats

　　NI Weigang, ZHOU Xiaoping, HU Xiaowu,  et al.

　　Department of Neurosurgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

　　Abstract:  Objective  To investigate the influence of high frequency electrical stimulus to the nucleus accumbens (NAc) on the formation of conditioned place preference (CPP) induced by morphine and role of NAc in the drug-addiction behavior in rats.  Methods  Twenty-six male SD rats successfully formed CPP induced by morphine were evenly randomized into 2 groups: the morphine stimulation group with 120 Hz stimulation to NAc, and pseudo-stimulation group. Morphine was injected 15 days later to induce CPP again, then CPP scores were measured and compared between two groups.  Results  CPP scores were 237.59±79.89 s and 441.29±212.68 s in morphine stimulation group and pseudo-stimulation group, respectively, which displays a significant difference between two groups (P<0.01) and means that the rats in stimulation group was no easier to recover to CPP to morphine.  Conclusions  High frequency electrical stimulation to NAc can obviously inhibit the reestablishment of morphine-induced CPP behavior. NAc is very important in the drug seeking behavior in drug-withdrawal animals.

　　Key words:  morphine;  nucleus accumbense;  electrical stimulation;  conditioned place preference　       复吸是药物依赖的主要特征之一，也是治疗药物成瘾要解决的主要问题。目前普遍认为：伏隔核 （NAc） 是药物心理依赖形成的关键所在,但伏隔核在药物诱发复吸中的作用尚不清楚[1]。本实验利用条件性位置偏爱 （conditioned place preference，CPP） 模型[2-3]，研究120 Hz高频电刺激NAc对吗啡戒断大鼠在吗啡注射诱导下位置偏爱行为的影响，旨在探讨NAc高频电刺激对大鼠心理依赖的影响。

　　1　   材料与方法

　　1.1　   材料与设备　   雄性SD大鼠40只 （第二军医大学实验动物中心提供），体质量220～260 g，随机分为吗啡电刺激组、吗啡假刺激组，每组20 只。饲养于控湿、控温[1]动物室，自由进食、饮水。盐酸吗啡 （沈阳第一制药厂生产）。CPP实验箱 （上海吉量公司生产），由铁质的黑、白盒构成，大小为37 cm × 39 cm × 30 cm，1个箱子具有黑色内壁和光滑地面，另1个具有白色内壁和粗糙地面。偏爱箱放入具有隔音和通风设备的木制箱内，木箱内空间大小为60 cm × 60 cm × 50 cm，六壁均为乳白色，顶部装1只5 W的白炽灯，箱子顶壁装有摄像头，记录大鼠的整个活动过程，经多线平行接口传送到计算机，再经轨迹分析计算出大鼠在不同箱体内的累计停留时间等数据。

　　1.2　   CPP实验    分为电极植入阶段、预测试阶段、训练阶段、测试阶段、CPP熄灭训练阶段和点燃复吸阶段等6个部分。

　　1.2.1    NAc电极植入：    大鼠用10%水合氯醛50 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定在江湾Ⅰ型C立体定向仪上，门齿杆高度低于耳间线3.0 mm，取前囟为O点，按照Paxinos和Waston大鼠脑立体定位图谱确定NAc靶点坐标；电极末端植入坐标：前囟前1.6 mm，中线旁开1.5 mm，颅骨下6.2 mm。消毒后切开头皮，根据电极末端植入坐标在颅骨表面确定标记点，颅骨钻孔4个，用电极末端刺破硬脑膜，植入自制同轴不锈钢双极电极外套管，其末端置于颅骨下6.2 mm，在颅骨表面另钻孔4个，拧入固定螺丝后，涂牙科水泥固定电极外套管。术后休息7 d。

　　1.2.2    预测试阶段 （d1）：    首先测试大鼠的天然环境嗜好。 一般条件下，大鼠对黑盒表现出天然嗜好，因此，训练阶段以白盒为伴药盒，以动物在伴药盒 （白盒） 的停留时间作为CPP得分。根据测试结果排除在15 min的前测中任何一侧箱体停留时间超过720 s的大鼠。

　　1.2.3    训练阶段 （d2～d7）：    在此期间，用隔板封闭两盒间通道。每只大鼠上下午各训练1次， 两次间隔6 h以上。其中一次在伴药盒内注射盐酸吗啡 （5 mg/kg背部皮下），另一次在非伴药盒内注射相同剂量的生理盐水，两次注射间隔6 h，交替进行 （如第1天早上注射吗啡，下午为生理盐水，则第2天早上为生理盐水，下午为吗啡，依此类推）。每次注射后让大鼠在注射侧箱体内活动30 min，然后取出置回饲养笼中。训练6 d。

　　1.2.4    测试阶段 （d8）：    在此阶段，将间隔板抬高12 cm，大鼠不注射药物及生理盐水，让其在两盒中间自由走动。 启动计算机程序，记录15 min内大鼠CPP得分。

　　1.2.5    CPP熄灭训练阶段 （d9～d24）：    吗啡电刺激组大鼠以10%水合氯醛麻醉，立体定向仪固定后，拔出电极外套管帽子，将电极内芯插进外套管内，进入长度15 mm，使其下端超出外套管下端2 mm并固定。再将同轴不锈钢电极的两极分别接JL-C2 型电刺激器输出端两极，刺激大鼠双侧NAc。刺激参数设定：强度5 V，波宽0.2 ms，频率120 Hz，3次/d，10 min/次，间隔10 min，重复3 次。刺激结束后拔出电极内芯，再用电极帽封盖电极外套管口。吗啡假刺激组麻醉后，进行如上操作，但不给予刺激 （假刺激）。刺激或假刺激结束后将大鼠放入伴药盒 （白盒） 中停留30 min，共15 d。第24天测试大鼠CPP得分。

　　1.2.6    点燃复吸阶段 （d25）：　   第25天，大鼠注射吗啡2.5 mg/kg，15 min后放入CPP实验箱，测量并记录CPP得分。整个实验过程中，保证箱内光线、色调、气味等环境条件一致。

　　1.3　   组织学评定　   实验结束后，两组大鼠均在10%水合氯醛麻醉下，心脏灌注4%多聚甲醛后取脑，以穿刺点为中心，作60 μm 冠状切片，采用Nissl染色观察，剔除双侧NAc区明显破坏或电极位置不正确的个体。

　　1.4    统计学处理    计算各组CPP得分的均值和标准差，数据以x ± s表示，组间均数的显著性检验采用独立样本t检验，训练前后比较采用配对t检验。

　　2　   结    果

    2.1    组织学分析    伏隔核坐标范围：前囟前2.70～0.48 mm，中线旁开0.40～2.60 mm，颅骨下6.0～8.0 mm。实验中电极外套管采用的定位坐标：前囟前1.60 mm，中线旁开1.50 mm，颅骨下6.20 mm。两组大鼠脑标本双侧NAc区定位准确，未见明显破坏 （图1）。

　　2.2　   电刺激NAc对吗啡注射诱导CPP的影响 （表1）　   实验过程中，8只大鼠因预测试阶段在黑箱停留时间超过720 s而被排除，6只大鼠死亡，因此，吗啡电刺激组和吗啡假刺激组完成实验大鼠各13只。两组中，第8天的CPP得分显著性高于第1天 （P ＜0.01），说明经过6 d的CPP训练，大鼠建立了对吗啡的CPP。第24天的CPP得分与第1天比较，差异无统计学意义 （P ＞0.05），说明经过15 d的熄灭训练后，大鼠的CPP已消失。吗啡假刺激组中，第25天的CPP得分为 （441.29 ± 212.68） s，第24天为 （266.98 ± 169.76） s，前者显著性高于后者 （P ＜0.01），说明吗啡注射恢复了大鼠对吗啡的CPP。在吗啡电刺激组中，第25天的CPP得分为 （237.59 ± 79.89） s，第24天为 （249.97 ± 85.05） s，两者差异无统计学意义 （P ＞0.10），说明电刺激组吗啡注射后大鼠未恢复对吗啡的CPP。总之，本研究结果表明：电刺激NAc能抑制大鼠的CPP重建，提示120 Hz电刺激NAc可抑制大鼠对吗啡的心理依赖。

　　3    讨    论

　　NAc与动机行为和奖赏行为密切联系，是成瘾药物的作用基础。阿片类药物 （如吗啡） 与脑内广泛分布的μ受体结合，直接或间接作用于中脑边缘多巴胺系统 （mesolimbic dopamine system，MLDS） 中的中脑腹侧背盖区 （ventral tegmental area，VTA）－NAc多巴胺通路，增加NAc多巴胺水平，产生奖赏效应[4]。本科室已完成80 Hz电刺激NAc对吗啡成瘾大鼠CPP的影响实验[5]，结果表明：80 Hz电刺激可能强化大鼠的觅药行为。临床在采用高频电刺激 （HFS） 治疗帕金森病人的过程中观察到：低频电刺激神经核团具有类似于激活该神经核团的作用，而高频电刺激则起到抑制或阻断相关神经传导通路的作用，故本实验将电刺激频率调整为120 Hz。

　　本实验中，吗啡假刺激组大鼠在CPP模型建立成功后，又经过15 d的熄灭训练，再次低剂量注射吗啡即可使动物恢复觅药行为。这种现象可用敏感化理论解释：长期用药引起脑内有关回路的一系列适应性改变，使药物依赖动物表现出行为敏感化，低剂量成瘾药物即可使这些动物产生药物渴求和复吸[6-7]。阿片类药物成瘾者经过系统治疗后，很长时间内只要看到或接触类似药物，即可能导致复吸，这也是药物依赖者复吸率高的原因之一。而吗啡电刺激组CPP模型建立后，经过15 d的熄灭训练，小剂量吗啡注射未恢复大鼠对吗啡的CPP，提示高频电刺激NAc能阻断吗啡注射诱发戒断大鼠恢复觅药行为，表明NAc在成瘾药物诱导复吸中起重要作用。这是因为，成瘾药物诱导复吸与MLDS系统中VTA－NAc多巴胺通路的激活有关。结合本研究结果，我们认为：长期用药可能引起MLDS系统中的VTA－NAc多巴胺通路发生敏感化改变，使药物依赖动物表现出行为敏感化。在戒断期，低剂量成瘾药物通过激活MLDS系统中的VTA－NAc多巴胺通路，恢复动物对药物相关刺激的兴趣，引起药物渴求，导致复吸；电刺激NAc切断该通路，阻止动物恢复对药物相关刺激的兴趣，从而阻断成瘾药物诱导戒断动物复吸。本实验结果为临床双侧高频电刺激NAc治疗药物成瘾提供了一定依据，但其具体作用机制尚有待进一步研究。

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