GHS-RⅠa mRNA 和GHS-RⅠb mRNA在生长激素腺瘤中的表达及临床意义

作者：王石雷， 叶 飞， 徐同江， 李 俊， 曾 亮， 雷 霆    作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经外科， 湖北 武汉

【摘要】  目的 检测生长激素释放剂受体 （GHS-R） GHS-RⅠa mRNA 和GHS-RⅠb mRNA在GH腺瘤中的表达，探讨其与GH腺瘤侵袭性的关系，分析其临床意义。 方法 采用RT-PCR技术检测手术切除的侵袭性 （22例） 和非侵袭性 （10例） 垂体瘤标本中，GHS-RⅠa mRNA 和GHS-RⅠb mRNA表达水平的差异。 结果 ①在侵袭性与非侵袭性GH腺瘤中二者表达的阳性率均为100%。②在表达强度上，GHS-RⅠa mRNA在GH腺瘤中表达明显高于GHS-RⅠb mRNA （P ＜0.05），GHS-RⅠa mRNA在侵袭性GH腺瘤中的表达明显高于非侵袭性GH腺瘤 （P ＜0.05），GHS-RⅠb mRNA在侵袭性与非侵袭性 GH腺瘤中的表达无明显差异 （P ＞0.05）。 结论 ①GHS-RⅠa mRNA在GH腺瘤中具有特异性过度表达，表明GHS-RⅠa可能在GH腺瘤的侵袭性中起一定的作用。②GHS-RⅠb mRNA在GH腺瘤中虽有表达，但与GH腺瘤侵袭性的关系尚不明确。

【关键词】  垂体肿瘤； 生长激素释放剂受体； 肿瘤侵润

Expressions of GHS-RⅠa mRNA and GHS-RⅠb mRNA in growth hormone-secreting

    pituitary adenomas and their clinical implication

    WANG Shilei, YE Fei, Xu Tongjiang, et al.

    Department of Neurosurgery, Tongji Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology,

    Wuhan, 430030, China

    Abstract:  Objective  To investigate the relationship between the expression of growth hormone (GH) secretagogue receptor (GHS-R)Ⅰa mRNA and GHS-RⅠb mRNA and the invasiveness of human GH-secreting pituitary adenomas (GHSPAs) and their clinical implication. Methods  The expression levels of GHS-RⅠa mRNA and GHS-RⅠb mRNA were examined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in 32 cases of GHSPAs, which were divided into invasive group (22 cases) and noninvasive group (10 cases).  Results  ① All adenoma samples showed the expression of GHS-RⅠa mRNA and GHS-RⅠb mRNA. ② The expression level of GHS-RⅠa mRNA was significantly higher than GHS-RⅠb mRNA in GHSPAs (P<0.05). The invasive adenomas had significantly higher expression intensity of GHS-RⅠa mRNA than the noninvasive group (P<0.05), but no significant difference between the two groups for the expression intensity of GHS-RⅠb mRNA (P>0.05).  Conclusions  ① The specific overexpression of GHS-RⅠa mRNA in human GHSPAs suggests that GHS-RⅠa mRNA play a certain role in the invasiveness of GHSPAs. ② GHS-RⅠb mRNA is expressed in human GHSPAs. The data are not enough to prove the relationship between GHS-RⅠb mRNA and invasiveness of human GHSPAs.

    Key words:  pituitary neoplasms;  growth hormone secretagogue receptor;  neoplasm invasiveness

    近年来，生长激素释放剂受体 （GHS-R） 途径在垂体生长激素 （GH） 腺瘤中的作用越来越受到重视。为此，我们拟用分子生物学中逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR），检测GHS-RⅠa mRNA 和GHS-RⅠb mRNA在人垂体GH腺瘤中的表达，探讨GHS-RⅠa mRNA和GHS-RⅠb mRNA与 GH腺瘤侵袭性的关系，分析其可能的临床意义，现将本组研究结果报告如下。

    1    材料与方法

    1.1    材料    标本取自2007年1月~12月同济医院神经外科手术切除的垂体腺瘤组织32例，病人均为肢端肥大症病人，术后病理诊断均证实为GH腺瘤。其中男性14例，女性18例；年龄16～66岁，平均40.8岁。病程0.4~6年。基础GH＜5 μg/L 3例 ，5~100 μg/L 23例，＞100 μg/L 6例。合并泌乳素 （PRL） 升高10例，促甲状腺激素 （TSH） 升高4例。免疫染色情况：GH （+） 32例，GH （+） 和PRL （+） 10例，GH（+）和TSH （+） 4例。微腺瘤3例，大腺瘤24例，巨大腺瘤5例。采用经鼻蝶手术入路27例，采用经额入路5例。将术中切除的垂体瘤标本，立即保存于－70 ℃超低温冰箱。垂体腺瘤侵袭性诊断标准：①术中或病理检查显示鞍底硬脑膜、骨质、蝶窦黏膜、正常垂体明显受肿瘤侵袭；②影像学提示腺瘤侵犯海绵窦等周围结构，或有鞍底骨质破坏。满足以上两项即可诊断肿瘤侵袭性。本组侵袭性垂体腺瘤22例，非侵袭性腺瘤10例。

    1.2    主要试剂及仪器设备

    1.2.1    主要实验试剂：    Trizon （Gibco公司），M-MLV逆转酶和Oligo （dT）-15引物 （Omega公司），GOLDVIEW （北京赛百盛），Taq DNA聚合酶 （Biostar公司），DL2000 Ladder自 （TakaRa公司）。

    1.2.2    主要仪器设备：    DNA/RNA分析仪 （Pharmacia Biotech公司），台式高速离心机 （美国Beckman公司），PTC-1148 PCR扩增仪 （美国Bio-Rad公司），电脑三恒电泳仪 （北京东方仪器厂），凝胶成像分析系统 （美国BIO-RAD公司）。

    1.3    方法    逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR）。

    1.3.1    引物设计及合成：    GHS-RⅠa、GHS-RⅠb和GAPDH引物由GeneFisher1.3软件自行设计，由武汉英骏公司合成 （表1）。

    1.3.2    总RNA提取：    TRIZOL试剂 （Gibco公司） 一步法分别提取超低温保存的垂体瘤标本组织的总RNA，产物用分光光度计检测浓度和纯度，选取纯度在1.6以上进行逆转录。取5 μg总RNA，用M-MLV逆转录酶进行逆转录，PCR扩增GHS-RⅠa和GHS-RⅠb，同时扩增GAPDH （230 bp） 作内参照。

    1.3.3    RT过程：　   以提取的总RNA为模板，按试剂盒说明书进行操作。逆转录步骤如下：提取的样品RNA 5 μl分别加入dNTP混合液，Oligo （dT）-15各1.25 μl （50 μg/ml），5 × M-mLV 扩增缓冲5 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，M-MLV逆转录酶1 μl 最后加DEPC水使总体积至25 μl混匀。RT反应条件为：70 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min简短离心混匀后，置42 ℃温育1 h，加热至95 ℃，5 min，置冰上3 min （或于－20 ℃保存）。

    1.3.4    PCR过程：    反应体系为25 μl，取上游引物 1 μl，下游引物1 μl，氯化镁2 μl，10 × Taq酶扩增缓冲液2.5 μl，dNTP1.5 μl，cDNA模板2 μl，Taq酶2 μl加dddH2O至25 μl 离心混匀。PCR反应条件为：95 ℃变性5 min，94 ℃变性30 s，57.7 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，31个循环，最后72 ℃延伸7 min，分别得到GHS-RⅠa、GHS-RⅠb和GAPDH的扩增片段，大小分别为226 bp、155 bp和230 bp。

    1.3.5    RT-PCR结果分析方法：    GHS-RⅠa、GHS-RⅠb目的片段、内参GAPDH的PCR产物分别经含5% GOLDVIEW的1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察、拍照。应用分析软件对各组RT-PCR结果目的条带校正灰度值与内参GAPDH校正灰度值作相对定量分析：以目的片段与内参片段灰度值之比表示，比值 0～1为“+”，比值1~2为“++”，比值＞2为“+++”。

    1.4    统计学分析    每例样本实验均重复3次，实验数据采用均值 ± 标准差表示，应用SPSS11.0统计软件，采用t检验和卡方检验进行分析，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

    2    结    果

    2.1    GHS-RⅠa mRNA和GHS-RⅠb mRNA的表达     RT-PCR检测结果显示：GHS-RⅠa mRNA和GHS-RⅠb mRNA在侵袭性和非侵袭性GH腺瘤中均有表达，表达率为100% （图1、2）。

    2.2    GHS-RⅠa mRNA在侵袭性与非侵袭GH腺瘤中的表达    ①侵袭性GH腺瘤的GHS-RⅠa mRNA表达“+”、“++”和“+++”的例数分别为7例 （32 ± 6）%，5例 （23 ± 3）%和10例 （45 ± 7）%；非侵袭性GH腺瘤表达“+”、“++”分别为9例 （90 ± 5）%和1例 （10 ± 3）%，而“+++”表达为0；两者之间具有显著性差异 （χ2检验，P ＜0.05）。侵袭性GH腺瘤的GHS-RⅠa mRNA水平高于非侵袭性GH腺瘤，二者具有统计学意义 （t检验，P ＜0.05）。②侵袭性GH腺瘤的GHS-RⅠb mRNA表达“+”、“++”和“+++”的例数分别为13例 （59 ± 8）%，9例 （41 ± 6）%和0；非侵袭性GH腺瘤表达“+”、“++”和“+++”分别为6例 （60 ± 7）%、4例 （40 ± 5）%和0；两者之间无显著性差异 （χ2检验，P ＞0.05）。③GHS-RⅠa mRNA在GH腺瘤中表达“+”、“++”和“+++”分别为16例 （50 ± 5）%、6例 （19 ± 4）%和10例 （31 ± 7）%；GHS-RⅠb mRNA在GH腺瘤中表达的“+”、“++”和“+++”分别为19例 （59 ± 8）%、13例 （41 ± 5）%和0；两者之间具有显著性差异 （χ2检验，P ＜0.05）。GHS-RⅠa mRNA在GH腺瘤中表达明显高于GHS-RⅠb mRNA （χ2检验，P ＜0.05）。

    GHS-RⅠa mRNA在人垂体GH腺瘤中具有特异性过度表达，表明GHS-RⅠa可能在GH腺瘤的侵袭性中起一定作用。GHS-RⅠb mRNA在人垂体GH腺瘤中虽有表达，但其与GH腺瘤侵袭性的关系尚不明确。

    3    讨    论

    1996年，Howard等[1]首先从人和猪垂体cDNA文库中成功分离得到两条不同的GHS-R cDNA，命名为GHS-RⅠa和GHS-RⅠb。随着研究的不断深入，发现GHS-R广泛分布于许多组织和器官，主要分布于垂体前叶和中枢神经系统。GHS-RⅠa mRNA主要表达于下丘脑、弓状核、腹内侧核、漏斗核、海马区及腺垂体[2]。同时，还在下丘脑以外的区域发现GHS-RⅠa mRNA的表达，如杏仁核和Cajal间质核[3]。Tanaka等[4]用RT-PCR检测表明垂体和脑中GHS-RⅠa表达含量最高。

    目前发现的GHS-R主要分两个亚型Ⅰa和Ⅰb，GHS-R基因由1个内含子连接两个外显子组成，转录时完全移除中间的内含子形成GHS-RⅠa mRNA，编码366个氨基酸残基，人和动物GHS-R基因序列有高度同源性[1-2，4]。GHS-R基因在转录时也可以通过在内含子的多腺苷酸位点选择性剪切并保留部分内含子序列，从而形成GHS-RⅠb mRNA，编码289个氨基酸残基[1]。GHS-R通过与其天然配体的结合从而激活G蛋白，并随后活化细胞内蛋白激酶C （PKC） 信号系统，升高细胞内Ca2+浓度，最后由Ca2+刺激GH的合成分泌，参与脉冲式GH释放调节，对GH的分泌效应呈相对特异性[1，5-10]。GHS-RⅠb不能结合GHS，目前尚未证明其生物学活性[1，5]，但该亚型末端富含丝氨酸-苏氨酸 （Ser-Thr），可以模仿G蛋白偶联的受体。如果把它们插入细胞膜中，可能将与G蛋白起到竞争结合的作用。检测GHS-RⅠa和GHS-RⅠb在mRNA水平的表达，可以为进一步在转录水平调控其表达，以检测细胞内分泌做好前期工作，进一步探讨GHS-R的作用机制[11]。

    Nass等[12]发现在GH缺乏症大鼠模型中，GHS-R表达异常增加，体外给予GH刺激可引起GHS-R相应减少，提示GHS-R类似于促生长激素释放激素 （GHRH） 等其他激素受体，受GH分泌的负反馈调节。显然，GH腺瘤GHS-R过度表达与这种负反馈机制的减弱有关，也可能是GH腺瘤过度分泌GH的病理基础之一[9-10，13]。

    为此，本研究应用RT-PCR方法检测在侵袭性和非侵袭性GH腺瘤中，GHS-RⅠa mRNA 和GHS-RⅠb mRNA的表达情况。通过RT-PCR检测证明在GH腺瘤中，GHS-RⅠa mRNA的表达水平与肿瘤侵袭性明显相关，侵袭性GH腺瘤表达水平远远高于非侵袭性GH腺瘤。虽然仅从RNA水平的表达不能阐明GHS-RⅠa mRNA作用于GH腺瘤的具体机制，但表明GHS-RⅠa mRNA可作为判断GH腺瘤预后及侵袭性的标志之一。同时GHS-RⅠb mRNA在GH腺瘤中也有表达，但未发现其与GH腺瘤侵袭性有明显的相关性，表明GHS-RⅠb mRNA在RNA水平的表达可能与肿瘤的侵袭性无关，其对GH腺瘤作用机制的影响尚不明确，有待进一步研究。

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