不同亚型髓母细胞瘤中PCNA的表达差异及意义

作者：王亚明,田增民    作者单位：100037 北京,中国人民解放军海军总医院全军神经外科中心

【摘要】  目的 探讨增殖细胞核抗原（PCNA）在不同病理亚型髓母细胞瘤中的表达差异和临床意义。方法 对34例髓母细胞瘤（经典型21例；促硬纤维增生型13例）进行PCNA免疫组化染色，测定不同亚型髓母细胞瘤的细胞增殖核抗原指数（PCNA LI）。结果 经典型髓母细胞瘤的PCNA LI为81.45%±9.29%，促硬纤维增生型髓母细胞瘤PCNA LI为39.86%±8.37%，不同髓母细胞瘤亚型的PCNA LI值存在显著差异。结论 PCNA的表达差异，为不同亚型髓母细胞瘤的生物行为学差异提供了病理学依据，PCNA LI可以作为髓母细胞瘤恶性程度及病人预后判断指标。

【关键词】  髓母细胞瘤；增殖细胞核抗原；亚型；

    The significance and different expression of PCNA in different subtype medulloblastomas  WANG Yaming ，TIAN Zengmin.Department of Neurosurgery, Navy General Hospital, Beijing 100037,China

    Abstract:Objective  To investigate the clinical significance and different expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in different subtype medulloblastomas.Methods  Immunohistochemical staining was used in 34  cases  of medulloblastoma specimens (21 cases of classical subtype;13 cases of desmoplastic subtype)to determine the PCNA labelling index (PCNA LI). Results  The PCNA LI of classical subtype was 81.45%±9.29% and  the PCNA LI of desmoplastic subtype was 39.86%±8.37%.There were remarkable difference between them. Conclusions  The different expression of PCNA in two subtypes provides pathological evidence to their distinct biological behavior, PCNA LI may be a promising future prognostic tool and potential biologic target in its malignancy.

    Key words:medulloblastoma;proliferating cell nuclear antigen(PCNA);subtype;

     髓母细胞瘤占儿童颅内肿瘤的18.5%，具有向胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤分化的特征，肿瘤细胞易脱落，可发生播散转移。临床最常见二种不同形态学特征的病理亚型：经典型和促硬纤维增生型［1］，不同亚型的生物学行为（恶性转化、侵袭、转移和对放化疗反应）及预后存在差异［2～5］。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA） 是一种调节细胞增殖的核蛋白，其在细胞中的表达能有效地反映细胞的增殖能力，已被广泛地用于肿瘤增殖活性的研究［5～7］。本研究用免疫组化染色和图像分析量化指标的方法，比较不同亚型髓母细胞瘤PCNA的表达差异及其与生物学行为的关系，探讨PCNA在评价髓母细胞瘤恶性程度和判断预后中的意义。

    1  材料和方法

    1.1  材料  34例髓母细胞瘤标本来自手术切除肿瘤，均经病理科明确诊断，并按照形态学特征进行分类，为了确定髓母细胞瘤的分化方向，部分标本进行了特异抗体的免疫组织化学研究，如：GFAP(+)为胶质细胞方向分化；NSE(+)、NF(+)、突触素SYN(+)为神经母细胞方向分化。根据组织细胞形态分类，经典型髓母细胞瘤21例（61.76%），促硬纤维增生型髓母细胞瘤13例（38.24%）。收集脑外伤手术中失活脑组织5例作为PCNA染色的阴性对照。

    1.2  主要试剂和仪器  鼠抗人PCNA单克隆抗体；封闭用羊血清；通用型生物素标记羊抗鼠IgG二抗；辣根酶标记链霉素卵白素工作液(SA/HRP) ；浓缩型DAB显色试剂盒；DAB增强剂 (北京中山生物技术有限公司)。MPISA500多媒体彩色病理图文分析系统（同济医科大学）。

    1.3  方法  肿瘤标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，每个标本切4张切片，片厚5 um，做HE染色，同时以鼠抗人PCNA单克隆抗体做增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色，其中阴性对照切片的一抗用PBS代替。

    1.4  细胞增殖核抗原指数（PCNA LI）测定  利用MPISA500多媒体彩色病理图文分析系统进行分析，在400倍光镜下，每个切片选取5个肿瘤病理学特征明显的视野分别记数阳性细胞百分数后取平均值，作为该组织切片的平均PCNA LI (血管内皮细胞不计算在内；肿瘤和正常组织交界区域不包括在内)。

    1.5  统计分析  利用t检验比较髓母细胞瘤不同病理亚型（经典型和促硬纤维增生型）之间PCNA LI的差异，统计分析采用spss10.0统计软件包，检验效能设为0.05。

    2  结  果

    2.1  髓母细胞瘤不同亚型形态学和染色差异  经典型髓母细胞瘤的肿瘤细胞原始形态由小的未分化的细胞紧密排列成片，细胞核致密浓染，圆形或多角型，周围胞浆很少，肿瘤细胞多形成旋涡或束状结构，细胞核可排列成血管周的假菊形团、或排列紧密呈栅栏状，肿瘤的基质成分很少，仅有散在的小血管增生样改变，细胞核分裂相与单个变性细胞核碎裂丰富（图1）。PCNA免疫组化染色见几乎所有的肿瘤细胞核均表现为明显棕褐色，染色强度深，布满整个视野（图2）。

    促硬纤维增生型肿瘤细胞成分少于经典型，肿瘤组织中有较多的胶原基质成分，这些胶原成分使肿瘤细胞排列成单行或梁柱状、旋涡状、编席状，认为这些胶原硬纤维可能是软脑膜间叶成分反应性增生的结果，此类型的另外一个重要形态学特征是出现微结节状网状纤维区即“苍白岛结构”，形态上类似滤泡增生型淋巴结，“苍白岛”的特点是内部细胞成分减少，主要由稀疏的胶质纤维网形成框架，其内散在分布着一些分化成熟的星形或少支胶质细胞样的细胞成份，部分细胞出现明显的胶质胞浆突起；有时还可见到圆形、流线状排列、分化良好的神经元成分（图3），表明促硬纤维增生型具有向成熟神经元或星形细胞分化的潜能。 PCNA免疫组化染色：“苍白岛”结构内部细胞成分核染色阴性，而周围“编席”状排列的低分化髓母细胞成分呈明显的核着色（图4）。

    图1    经典型髓母细胞瘤HE染色，可见肿瘤细胞密集，胞核呈圆形或多角型，胞浆极少，部分呈“裸核”，染色质丰富，核致密深染，核分裂相多见，细胞核围绕血管周排列成“假菊形团”状 （200×）。图2    经典型髓母细胞瘤PCNA免疫组化染色，几乎所有肿瘤细胞核均呈明显棕褐色“阳性”深染（200×）。图3    促硬纤维增生型髓母HE染色，肿瘤细胞成分少于经典型，在较多胶原基质成分中，细胞排列成梁柱或旋涡状，出现典型的“苍白岛”结构，岛内由稀疏的胶质纤维网形成框架，中间散在分布着分化成熟的星形胶质细胞和圆形分化良好的神经元（100×）。图4  促硬纤维增生型髓母PCNA免疫组化染色，“苍白岛”内部分化成熟的细胞核染色阴性，不着色；而周遍“编席”状分化差的肿瘤细胞呈深棕褐色阳性着色（100×）。2.2  不同亚型PCNA LI差异  阴性对照的5例正常脑组织PCNA染色阴性，21例经典型髓母细胞瘤的PCNA LI平均值为81.45%±9.29%，13例促硬纤维增生型髓母PCNA LI平均值为39.86%±8.37%。t检验证实不同髓母细胞瘤亚型的PCNA LI值（P<0.01）存在显著差异。促硬纤维增生型的PCNA LI值和切片染色强度显著低于经典型髓母细胞瘤。

    3  讨  论

    增殖细胞核抗原PCNA是DNA聚合酶δ亚单位的一种辅助蛋白，直接参与DNA的合成，它在细胞处于G1、G2和M期时表达很低，当细胞处于G1后期和S期时显著增高，是反映细胞增殖活性的客观指标。PCNA指数(PCNA LI)越大，表明处于S期的细胞越多，即肿瘤细胞的增殖活性越强，恶性程度越高［5～7］。

    髓母细胞瘤在病理形态学上分为：“经典型”、“促硬纤维增生型”、“大细胞型”、“间变型”四个亚型［1］，临床上最常见的是：“经典型”和“促硬纤维增生型”，二者在分化程度和生物学行为上存在显著差异［2～4］。本研究通过对21例经典型和13例促硬纤维增生型髓母细胞瘤的PCNA免疫组化染色，测定细胞增殖核抗原指数（PCNA LI）发现，经典型髓母的平均PCNA LI为81.45%±9.29%，显著高于促硬纤维增生型髓母的平均PCNA LI值（39.86%±8.37%），t检验显示二者存在显著性差异，说明经典型髓母细胞瘤的细胞增殖活性和恶性程度要高于促硬纤维增生型髓母，从客观上证实二亚型在生物行为差异的根源，为临床判断不同亚型肿瘤的恶性程度和预后提供理论依据。

    病理形态研究认为“促硬纤维增生亚型”中的“苍白岛”内部是分化成熟、增殖活性较低的细胞成分［3，4］，但一直没有客观证据，对此亚型PCNA免疫组化染色观察及PCNA LI的测定证实了这一点，而且为此亚型的变异机制的推测，提供了新的假设。促硬纤维增生型髓母细胞瘤的形成可能有两种机制：（1）多中心起源说：促硬纤维增生型肿瘤细胞起源是多中心的，有基因突变的细胞向髓母细胞瘤方向发展，而基因表达正常的细胞则向成熟神经元或胶质细胞方向发展形成“苍白岛”结构。（2）“基因突变后成”说认为：髓母细胞瘤可能有相同细胞起源，但在细胞分化发展过程中，部分细胞因为基因突变向髓母细胞瘤方向发展，而残余的正常细胞则向分化程度高方向发展，形成“苍白岛”样结构。

    PCNA在髓母细胞瘤的强烈表达提示肿瘤细胞生长增殖旺盛，是恶性程度高的表现，肿瘤成分中有些瘤细胞不表达PCNA，说明在肿瘤细胞群体中并非是所有的细胞同步增殖的，反应了肿瘤细胞的异质性。不同亚型髓母细胞瘤中PCNA的表达差异，反映了髓母细胞瘤中各细胞成分的差异性增殖和分化，也为不同亚型的生物行为学（侵袭性、分化程度）和恶性程度差异提供了病理学依据，因此PCNA的测定可以作为髓母细胞瘤生物学行为及预后判断的有用指标。

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