经股动脉入路建立球囊损伤兔颈动脉狭窄模型

作者：柯炎斌， 陆永建， 李明昌， 何伟文， 伍健伟， 梁建峰    作者单位：广州医学院第二附属医院神经外科， 广东 广州

【摘要】  目的 经股动脉入路制作一种实用、可靠且稳定的颈动脉狭窄模型，用于探讨颈动脉再狭窄的防治。 方法 新西兰大白兔20只，随机分为对照组、实验1周组、实验2周组和实验4周组，每组5只，常规喂养。所有动物采用经右侧股动脉入路置入HyperForm球囊，实验组行右颈总动脉定比扩张，对照组行单纯右颈动脉路图显示，术后以普通饮食喂养。实验1、2、4周组实验兔分别于手术后 1 周、2 周和4 周处死，并在第4 周同时处死对照组兔。右颈动脉分叉近心端1~2 cm节段取材送光镜和电镜检查，分别观察血管壁增生情况并计算血管内膜和中膜厚度。 结果 与对照组比，实验组新生内膜厚度呈持续性显著增加 （P ＜0.01)，实验2周组与实验1周组比较及实验4周组与实验2周组相比，内膜厚度均显著增加 （P ＜0.01）。各组中膜厚度未见明显统计学差异 （P ＞0.05）。 结论 经股动脉入路用HyperForm球囊行颈动脉定比扩张能成功地制作一种稳定、简便可靠的颈动脉狭窄动物实验模型。血管平滑肌细胞的过度增生是造成PTA术后管腔再狭窄的主要因素。

【关键词】  颈动脉狭窄； 兔； 模型，动物

Establishment of rabbit carotid artery stenosis model after balloon injury via femoral artery approach

    KE Yanbin, LU Yongjian, LI Mingchang, et al.

    Department of Neurosurgery, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510260, China

    Abstract:  Objective  To establish a practical and stable carotid artery stenosis model via femoral artery approach and discuss the prevention and treatment of carotid artery restenosis.  Methods  Twenty New Zealand rabbits were randomly divided into 4 equal groups (control group, groups 1-week, 2-week and 4-week), 5 each, and fed under conventional feeding condition. The HyperForm balloon catheter was introduced into the right common carotid artery (CCA) through a small window in the right femoral artery. Road map of the right CCA was drawn in the control group. In the test groups, inflated balloon was placed to mechanically expand the right CCA. The rabbits were given normal diet feeding after operation. At 1st, 2nd and 4th week after the balloon injury, the rabbits of groups 1-week, 2-week and 4-week were killed respectively. The rabbits in the control group were also killed at the 4th week. 1-2 cm segment proximal to the right CCA bifurcation were taken for light and electron microscopy to observe vascular proliferation and calculate the thickness of vascular intima and media.  Results  Compared with the control group, the mean thickness of neointima in test groups were significantly increasing (P<0.01). Compared with the group 1-week and group 4-week, the thickness of intima in group 2-week significantly thickened (P<0.01). There was no statistical difference in tunica media thickness between the groups (P>0.05). Conclusion  A practical carotid artery stenosis model is successfully established by proportionally expanding the CCA with HyperForm balloon, which also can stimulate the pathological process of the injured endothelium after angioplasty. Hyperproliferation of vascular smooth muscle cells is a main factor of artery restenosis after percutaneous transluminal angioplasty.

    Key words:  carotid stenosis;  rabbits;  models, animal

    颈动脉内支架成形术 （carotid artery stenting，CAS） 是一种治疗颈动脉狭窄的有效方法，但研究表明其术后常会发生程度不同的再狭窄，影响手术效果和预后[1]。建立与人类颈动脉球囊扩张损伤性狭窄近似的动物模型，是进一步开展血管成形术后再狭窄机制实验研究的基础。本研究采用与临床介入治疗相同的路径，通过经股动脉入路应用HyperForm球囊损伤的方法建立了一种兔颈动脉狭窄模型。

    1    材料与方法

    1.1    试验动物及分组    新西兰大白兔20只，由广东省动物实验中心提供，雌雄不限，体质量2.6～3.2 kg，随机分为正常对照组、实验1周组、实验2周组和实验4周组，每组5只。常规喂养。

    1.2    模型制作    ①安定 （1 mg/kg） 大腿根部肌肉注射，然后用25%乌拉坦 （4 ml/kg） 行耳缘静脉缓慢注射。②麻醉成功后，将兔仰卧固定于造影台上。右下肢根部备皮后，局部碘伏消毒。铺盖孔巾。③摸清股动脉搏动后，沿股动脉走行方向切开皮肤，逐层分离皮下组织及肌肉至暴露股动脉，将其与静脉和神经分离。④在股动脉上切开一小口，置入4F动脉导管鞘，沿鞘注入肝素钠盐水 （200 IU/kg），侧孔接高压滴注。⑤留取5F造影管尾端4 cm接Y阀后插入动脉导管鞘。自Y阀插入HyperForm球囊导管 （ev3公司），在透视下经导丝引导至右颈总动脉 （CCA） 分叉近心侧约1 cm处。将导丝退至球囊下方，制作路图并记录，测量各实验兔的原始颈动脉内径。实验组在“路图”模式下充盈球囊，将颈总动脉扩张至原管径的1.5倍。每次扩张30 s，连续3次，每次间隔30 s。对照组单纯显示“路图” （图1）。⑥退出球囊和动脉导管鞘，股动脉切口两端用丝线结扎。缝合肌肉和皮肤。常规喂养。

    1.3    狭窄颈动脉病理学检查    实验1、2、4周组分别于手术后1 周、2周和4周处死模型兔，并在第4周同时处死对照组实验兔。取材时，在颈部正中切口暴露右侧CCA，取自颈动脉分叉近心侧CCA 1~2 cm节段送检，分别进行光镜与电镜观察。光镜观察者采用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片厚约5 μm，苏木精-伊红染色常规观察；电镜观察者采用3%戊二醛固定。用显微镜和计算机分析系统分别计算狭窄段内膜厚度和中膜厚度。

    1.4    统计学分析    采用SPSS 13.0统计软件包，数据以x ± s表示，多组比较及两两比较均采用方差分析，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

    2    结    果

    2.1    血管壁病理形态学变化 （图2）

    2.1.1    对照组：    光镜下观察无内膜增厚。电镜下观察管腔面被覆的单层血管内皮细胞连续，内弹力板完整，内弹力板内有极少量结缔组织，无平滑肌存在。内弹性膜深层有较多胶原原纤维、弹性纤维和基质，平滑肌细胞 （SMC） 散在其中 （图2A）。

    2.1.2    实验1周组：    光镜下见少量未溶解血栓呈玻璃样变，较明显的SMC移位生长，内膜增厚，细胞排列紊乱，少量炎性细胞浸润。电镜下管腔面可见扁平状内皮细胞，但内皮不连续，内弹力板不完整，有断裂，内皮细胞排列密集，紧邻内皮细胞下可见到多个紧密排列的新生血管平滑肌细胞 （VSMC），深层可见大量胶原原纤维及基质 （图2B）。

    2.1.3    实验2周组：    光镜下可见内膜明显增厚，主要成分为VSMC和周围基质，SMC呈环形排列，近中膜处细胞排列较为紊乱。电镜下可见内皮细胞核呈长椭圆形，紧邻内皮细胞下可以见到新生VSMC，其核呈不规则形，在细胞质中可见大量细胞器，表明其功能极为活跃，此类细胞周围可见大量胶原原纤维 （图2C）。

    2.1.4    实验4周组：    光镜下可见内膜增厚更加明显，增生内膜中SMC相对减少，中膜SMC排列尚整齐，SMC周围基质明显增加。电镜下可见内皮细胞呈中等电子密度，VSMC胞质中仍可见大量的细胞器 （图2D）。

    2.2    各组血管壁增生情况 （表1）    与对照组比较，实验组新生内膜厚度呈持续性显著增加 （P ＜0.01）。实验2周组与实验1周组比较，及实验4周组与实验2周组比较，内膜厚度均显著增加 （P ＜0.01）。各实验组间中膜厚度无明显差异性 （P ＞0.05）。

    3    讨    论

    颈动脉狭窄主要是血流剪切力等因素造成血管内膜损伤，引起血管平滑肌细胞过度增殖和迁移，导致内膜增厚、重建的结果。有关颈动脉狭窄模型制作的报告已不少。从实验动物的选择上看，用于制作颈动脉狭窄模型的实验动物有兔、大鼠、猪、犬及猴[2-4]。大型动物费用较高且饲养不便，大鼠模型颈动脉较细，必须使用显微镜且手术视野小不便于操作。大白兔颈动脉较粗，手术视野大且易于辨认，便于操作、分离颈动脉，可在肉眼直视下手术；同时兔生命力强，价格低廉、易获得、制作模型所需周期短，因而是制作颈动脉经皮腔内血管成形术 （PTA） 狭窄模型比较理想的实验动物。从建立模型的方法上讲，高脂喂养兔诱发颈动脉狭窄的模型较接近人类，发病过程及病理变化比较相似，但其饲养周期长，诱发的颈动脉狭窄模型发生率低且不稳定，因而实用价值较低。内膜烧灼法、内膜气体干燥损伤法、电刺激法和硅胶橡圈法等操作较为简便，但同样无法形成稳定的狭窄程度[3]。

    本研究采用家兔成功地经股动脉入路制作了颈动脉狭窄动物模型。其优点是：既往的球囊成形造模多采用直视下切开颈动脉后置入球囊，与临床介入治疗颈动脉狭窄的路径不一致；或者采用定压球囊扩张的方法，忽略了原管径大小的差异性，使得扩张程度不一，对照性下降。本组动物模型的制作基本模拟了临床介入治疗途径，经股动脉入路行颈动脉PTA，在透视下根据每根颈动脉的具体管径采取定比扩张，成功地模拟了PTA术后血管内皮和内膜损伤后的病理过程，包括内皮破坏、内皮下胶原暴露、平滑肌增生及细胞外基质增生等。国内外针对再狭窄的研究大多采用独立的不可脱球囊扩张法获得再狭窄模型，而本实验采用HyperForm封堵球囊 （美国ev3公司），其操作极为简便，可同时用于造影及球囊扩张，避免了更换导管和球囊等繁琐的操作步骤及由此引起的“路图”模糊、数据不准等现象。新西兰大白兔颈总动脉管径约为2.4 mm，所采用的HyperForm球囊扩张后直径可达4 mm，长度为1 cm，扩张比例可控制在1.5左右。兔颈动脉经扩张后1周即可见内皮细胞剥脱、不连续，内弹力板回缩、不完整，有断裂，其间有炎症细胞浸润； VSMC大量增殖，迁移入内膜并引起细胞外基质大量增生沉积，周围有大量胶原纤维，新生内膜显著增生，新生内膜厚度在损伤后开始至伤后第4周呈进行性增加，细胞排列紊乱，内膜增厚不均匀。提示血管平滑肌细胞的过度增生是造成管腔狭窄的主要因素[5]。与其他同类研究相似，本研究同样引起了明显的颈动脉内膜增厚[6]。

    分析统计数据可看出：各实验组动物形成的内膜增厚程度较为稳定，且实验过程中动物死亡率低，术后恢复快。说明通过经股动脉穿刺应用HyperForm球囊行颈总动脉定比扩张的方法能建立一种稳定的、简便实用的颈动脉狭窄模型。

    建立可行和稳定的颈动脉PTA实验动物模型，与颈动脉PTA后再狭窄的实验研究密切相关。本组研究成功地建立了颈动脉狭窄的实验动物模型，为下一步开展防治颈动脉再狭窄的实验研究打下了坚实的基础。

【参考文献】[1] TANIMOTO S, IKARI Y, TANABE K, et　al. Prevalence of carotid artery stenosis in patients with coronary artery dis- ease in Japanese population [J]. Stroke, 2005, 36(10): 2094- 2098.

[2] TODAKA T, YOKOYAMA C, YANAMOTO H, et al. Gene transfer of human prostacylin synthase prevents neointimal formation after carotid balloon injury in rats [J]. Stroke, 1999, 30(2): 419-426.

[3] 刘恒方, 黄晓松, 刘尊敬. 颈动脉狭窄动物模型制作的研究进展 [J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2006, 33(1): 62- 65.

[4] 李永秋, 徐明, 姚绍鑫, 等. 实验性家兔颈动脉球囊扩张动脉狭窄动物模型的建立 [J]. 中国动脉硬化杂志, 2003, 11(3): 263-266.

[5] ROSS R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s [J]. Nature, 1993, 362(6423): 801-809.

[6] 叶炳华, 管耘园, 卢辉和, 等. 不同大小球囊损伤术加高脂饲料建立兔颈动脉粥样硬化模型的比较 [J]. 南通大学学报（医学版）, 2006, 26(4): 244-246.