神经干细胞与颞叶癫痫

    作者：王焕明， 徐如祥    作者单位：430015武汉，湖北省新华医院神经外科（王焕明），南方医科大学珠江医院神经外科（徐如祥）

    【关键词】  神经干细胞 颞叶癫痫

    流行病学调查资料显示，癫疒间在我国的患病率约为十万分之7。以此推算，我国癫疒间的患病人数约为900万，其中约75%～80%的病人可以用药物控制。即使如此，仍然有约20%～25%的患者无法用药物控制发作而成为难治性癫疒间。颞叶癫疒间( temporal lobe epilepsy, TLE)是难治性癫疒间中最常见的一种类型，是指那些起源于颞叶的有简单部分性发作、复杂部分性发作或继发全身性发作特征的一类癫疒间，约占难治性癫疒间总数的60%左右。研究显示，颞叶癫疒间患者中约65%～70%存在一侧海马硬化，即海马神经元脱失和胶质增生。尽管对海马和杏仁核行选择性切除可使一部分病人得以痊愈，但手术本身有一定的危险性，可引起偏瘫、偏盲、记忆损害等，且对双侧海马硬化的患者不宜作双侧切除。因此，通过神经干细胞移植进行海马功能的修复和重建，可以从一个新的角度来探索改善颞叶癫疒间的发作频率和程度，具有潜在的临床意义。

    1  神经干细胞的特性

    1.1   神经干细胞的定义  神经干细胞(neural stem cell, NSC)是指未达终末分化状态，能产生神经组织或起源于神经系统，具有自我更新和复制能力，通过非对称性细胞分裂产生不同子代细胞的未定型细胞。它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当的条件下可分化为神经元、少突胶质细胞和星形细胞。

    1992年，Reynolds［1］等首次从成年鼠纹状体中分离出能在体外持续增殖且有向神经元及星形细胞分化潜能的细胞群，并证明在成年鼠脑内也存在有干细胞特性的细胞群。1997年，Mckay［2］在Science上定义NSC是具有能进行自我复制、自我更新和多分化潜能，并且能分化为本系大部分类型的细胞。此外，它还可通过不对称分裂产生除其自身以外的细胞，它的自我更新和多分化潜能可维持至终生，对损伤和疾病具有反应能力。1998年，Eriksson［3］等证实成年人脑中的室管膜下区、海马、纹状体和中脑等同样存在NSCs。

    神经干细胞存在于胚胎神经系统及成年脑的某些特定部位，其特征性的生物学标志为神经巢蛋白(nestin)［4］。胚胎神经干细胞的分裂、增殖、分化是神经系统发生的基础，成年神经系统中干细胞的功能还不十分明确，一般认为它们(尤其是位于海马区的干细胞)很可能与认知功能密切相关，是神经功能可塑性的基础。具体的说就是在某些外界环境影响下，干细胞在局部生成的新神经元可以参加记忆的形成和整合，即大脑控制行为，而行为又反过来影响大脑的结构。

    迄今为止，人们在发育中的胚胎和成年个体脑区都成功地分离出符合上述定义的神经干细胞。在哺乳类动物如大鼠的胚胎大部分脑区如皮层、室管膜下层、纹状体、海马和中脑等区域都存在神经干细胞，而在正常成年大鼠纹状体、皮层和室管膜下层也都证实了神经干细胞的存在。此外，在人胚的皮层和纹状体也成功分离出了神经干细胞。

    1.2   神经干细胞的基本特征  人们通常把不对称分裂看作是干细胞的一个特性，但在神经干细胞则是例外。神经干细胞的分裂也有对称分裂，在对称分裂的情况下产生的两个子代细胞可以均是干细胞，也可以均是祖细胞；而在不对称分裂的情况下，则产生一个干细胞和一个祖细胞，这样既能维持干细胞的自我更新，又能不断产生祖细胞以补充分化的祖细胞。对称分裂方式便于一些因子调控干细胞和祖细胞的相对比例，而不对称分裂中干细胞则保持相对稳定。

    自我更新是神经干细胞的一个基本特征，神经干细胞在生长因子的维持下能不断增殖，并维持神经干细胞的特性。生长因子主要包括表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在干细胞的体外实验中，在丝裂原信号的刺激下神经干细胞能维持相当长的时间。而在永生性神经干细胞系中，增殖和自我更新的能力更为突出，不使用丝裂原信号也能维持干细胞的属性。

    多分化潜能是神经干细胞的另一个特征，无论是生长因子维持的干细胞还是永生性干细胞均能在体外分化为三种主要的神经细胞，即神经元、少突胶质细胞和星形细胞。分化后使用免疫组化可以显示有大量的这些细胞的标记物。同时还可以见到TH、5TH阳性细胞。电生理实验证实有谷氨酸、GABA和乙酰胆碱等神经递质的存在。组细胞的分化潜能相对于干细胞则受到限制，只具有单潜能或双潜能分化的能力。

    2  神经干细胞与颞叶癫疒间

    2.1  神经干细胞在颞叶癫疒间中的增殖和分化  研究显示，癫疒间发作诱导的脑损伤在成熟的啮齿动物齿状回会导致各种形式的神经可塑，包括轴索重组、星形胶质细胞活化、树突重组和颗粒细胞层分散。Parent［5］等采用匹罗卡品制作大鼠癫疒间持续状态(Status Epilepticus,SE)模型，致疒间前1 d经全身投给溴脱氧尿核苷(BrdU)以标记具有增殖能力的神经干细胞，之后的2～14 d用免疫组化的方法确定被标记的细胞，结果发现经过4～7 d的潜伏期后，SE可以加速这些干细胞的增殖，并且在损伤的部位首先发生细胞分裂。研究发现，疒间性发作诱导损伤后，在尾侧脑室下区、胼胝体间区和海马的CA1和CA3区，神经干细胞增殖并具有迁移细胞的形态学。所有这些细胞呈现出少突胶质细胞和星形胶质细胞的形态，并且不再有神经元标志物的表达。而对照组仅在尾侧脑室下区和胼胝体出现标记细胞，这些结果提示，匹罗卡品诱导的SE能够加速尾侧脑室下区神经干细胞的增殖。Sato［6］等使用氯化锂和匹罗卡品联合诱导大鼠颞叶癫疒间模型，并用免疫组化方法动态检测大鼠海马多唾液酸神经细胞黏附因子(PSANCAM)及BrdU的表达，结果显示海马齿状回的PSANCAM及PSANCAM/ BrdU的阳性细胞在癫疒间后3 d开始增加，14 d达到高峰，说明癫疒间发生后出现神经干细胞的增殖和迁移，也出现了神经发生和可塑性改变。

    疒间性发作后引起的神经元生成增加提示在损伤部位可能有代偿作用。癫疒间的海马结构中新生成的齿状回颗粒细胞可能起到异常的苔藓纤维重组的作用。在匹罗卡品颞叶癫疒间模型中，典型的苔藓纤维异常重组开始于SE后的第2周，约2个月后达到高峰。长期的疒间性发作可能会诱发齿状回颗粒细胞的出现，随后神经的分化数量增加，并与苔藓纤维重组的时程相平行。这种疒间性发作诱导的新生颗粒神经元和苔藓纤维异常重组与人类颞叶癫疒间的病理非常相似。Scharfman［7］等研究了癫疒间鼠齿状回新生颗粒细胞的电生理特征，结果发现这些神经元保持着颗粒细胞的许多电生理特性。但与成熟的颗粒细胞不同的是，这些新生的颗粒细胞表现出与CA1区锥体细胞同步异常放电，且明显多于正常。Ribak［8］等发现，新生颗粒细胞中兴奋性突触显著增加，说明这种突触重组可能是导致疒间性发作的一种机制。

    2.2    神经干细胞诱导分化为GABA能神经元  γ氨基丁酸(GABA)对中枢神经系统具有普遍抑制作用，是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，脑内约有20～30%的突触以GABA为递质。其在多种神经系统疾病，尤其是颞叶癫疒间的病理生理机制上起一定作用。当脑内GABA浓度降低40%时，就可以引起自发性癫疒间发作。有关脑内诱导神经干细胞分化为GABA能神经元的研究，目前虽然少有报道，但诱导神经干细胞分化为GABA能神经元，补充海马神经元数量，将会使颞叶癫疒间的治疗变得更为简单；另外，将神经干细胞作为载体，转入表达GABA神经递质的基因，然后植入到海马组织，也是治疗颞叶癫疒间的途径。

    Carlos［9］等研究了神经干细胞体外诱导分化为兴奋性和抑制性神经元的组织培养条件，并证实增殖的海马干细胞可分化为谷氨酸能和GABA能神经元，在这些神经元之间能建立功能性的突触联系。其电生理学研究也表明神经干细胞分化的细胞具有神经元的形态和功能，在诱导分化后的第6天出现膜兴奋性的成熟，且这种成熟过程可持续到第18天。Hiroki［10］等在一层神经胶质滋养层上克隆培养了成年鼠海马的神经干细胞并测试其分化能力，结果发现分化的神经干细胞具有膜的兴奋性及谷氨酸能和GABA能的突触转运。因此认为来自成年鼠海马的神经干细胞在体外可分化为具有功能性突触的功能性神经元。通过电镜也观察到突触样的超微结构，即化学性突触的多形性囊泡结构。Fraichard［11］等在特定的条件下体外将胚胎干细胞首先诱导分化为神经元神经胶质前体细胞，然后再分化为胶质细胞和功能性神经元，在分化出的功能性神经元中，有些神经元内存在GAD酶合成，且这些细胞常成簇生长，说明其内就有成熟的GABA能神经元。刘卫平［12］等利用寡核苷酸序列特异性阻断了碱性螺旋环螺旋(basic helixloophelix, bHLH)基因家族的调控因子之一Hes1，从而大大提高了神经干细胞向GABA能神经元分化的比率，由对照组的18%增加到实验组的86%。这样就得到了较高比率的GABA能神经元，为以后的进一步研究颞叶癫疒间模型的细胞移植治疗提供了良好的基础。

    2.3   神经干细胞移植治疗颞叶癫疒间  近年来，神经干细胞移植在神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨默氏病、中风等已显示出巨大的神经系统功能重建作用，提示通过神经干细胞移植也可以进行海马功能的重建，以改善颞叶癫疒间患者的发作，提高患者的生活质量［13］。

    Chu等［14］使用氯化锂和匹罗卡品制作鼠SE模型，并在SE的第二天将带有标记的人神经干细胞通过静脉注射到大鼠体内，结果发现人神经干细胞能够抑制大鼠的自发性癫疒间发作，移植入鼠体内的神经干细胞在受损海马内分化为GABA反应阳性的中间神经元，且大鼠海马CA1区兴奋性突触后电位明显下降，说明神经干细胞能够分化为抑制性中间神经元，并减少神经元的兴奋性，从而防止大鼠SE模型的自发性癫疒间发作。Ruschenschmidt［15］等使用匹罗卡品制作大鼠慢性癫疒间模型，并将荧光蛋白标记的胚胎干细胞移植到双侧海马中，结果发现移植13～34  d后，大多数移植的神经干细胞在宿主海马中并不迁移，但却能增加宿主的神经环路，所有移植的神经干细胞都能产生动作电位，同时大多数干细胞都能接受NMDA和GABAA受体介导的突触传导，说明移植的神经干细胞具有内生神经元的特点。林志国［16］等分离、培养了新生鼠的海马干细胞，制作了海人酸（Kainic Acid, KA）颞叶癫疒间动物模型，并采用立体定向技术将海马干细胞移植到大鼠海马内，结果显示移植的海马干细胞可以显著抑制KA引起的苔状纤维发芽，减轻CA3区锥体细胞缺失，同时减少癫疒间动物的疒间性发放，并降低其癫疒间波幅约50%，提示神经干细胞移植对于KA诱发癫疒间鼠具有显著的修复作用。

    3  展  望

    尽管关于神经干细胞移植治疗颞叶癫疒间已经取得了一些进展，但仍有一些问题尚未解决，如神经干细胞的脑内移植的最佳时机如何？神经干细胞移植是否有产生肿瘤的可能？神经干细胞移植后是否存在免疫反应？目前，研究人员已将神经干细胞视为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料,采用外源性神经干细胞和神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植治疗颞叶癫疒间已被公认具有很好的治疗前景。相信随着人们对神经干细胞认识的不断深入,同时在细胞和分子水平上对癫疒间发作后继发损伤的病理机制研究的不断深入,其对颞叶癫疒间治疗在基础及临床的探索方面必将显示广阔的前景。

【参考文献】［1］ Reynolds BA, Tetzlaff W, Weiss S. A multipotent EGFresponsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes［J］.J Neurosci, 1992,12:4565.

［2］ Mckay R. Stem cells in the nervous system［J］. Science,1997,276:66.

［3］ Eriksson PS, Perfilieva E, Bjork ET, et al. Neurogensis in the adult human hippocampus［J］. Nat Med, 1998,4:1313

［4］ Kim HM, Qu T, Kriho V, et al. Reelin function in neural stem cell biology［J］. Proc Natl Acad Sci USA.,2002,99:4020.

［5］ Parent JM, Tada E, Fike JR, et al. Inhibition of dentate granule cell neurogenesis with brain irradiation does not prevent seizureinduced mossy fiber synaptic reorganization in the rat［J］. J Neurosci,1999,19:4508.

［6］ Sato K, Iwai M, Nagano I, et al. Temporal and spacial changes of highly polysialylated neural cell adhesion molecule immunoreactivity in amygdala kindling development［J］.Neurol Res,2003, 25: 79.

［7］Scharfman HE, Goodman JH, Sollas AL, et al. Granulelike neurons at the hilar/CA3 border after status epilepticus and their synchrony with area CA3 pyramidal cells: functional implications of seizureinduced neurogenesis［J］.J Neurosci,2000,20:6144.

［8］Ribak CE, Tran PH, Spigelman I, et al. Status epilepticusinduced hilar basal dendrites on rodent granule cells contribute to recurrent excitatory circuitry［J］. J Comp Neurol,2000,428:240.

［9］ Carlos VA, Carlos C, Pantelis T, et al. Hippocampal stem cells differetiate into excitatory and inhibitory neurons［J］.Eur J Neurosci,2000,12:677.

［10］Hiroki T, Jun T, Akira M, et al. Neurons generated from adult rat hippocampal stem cells form functional glutamatergic and GABAergic synapses in vitro［J］. Exp Neurol, 2000,165:66.

［11］ Fraichard A, Chassande O, Bilbaut G, et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons［J］.J Cell Sci,1995;108:3181.

［12］刘卫平,潘灏,章翔,等.神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化［J］.中华神经外科疾病研究杂志,2005,4:44.

［13］ Grisoli JS.Stem Cell Grafting for Epilepsy: Clinical Promise and Ethical concerns［J］.Epilepsy Behav, 2001,2:318.

［14］Chu K, Kim M, Jung KH, et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpineinduced status epilepticus in adult rats［J］. Brain Res, 2004,1023: 213.

［15］Ruschenschmidt C, Koch PG, Brustle O, et al. Functional properties of ES cellderived neurons engrafted into the hippocampus of adult normal and chronically epileptic rats［J］.Epilepsia, 2005;46:174.

［16］林志国,沈红,王晓峰,等.大鼠海马干细胞移植治疗颞叶癫疒间的初步研究［J］.立体定向和功能性神经外科杂志,2004,17:39.