纹状体组织提取液诱导人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的实验研究

作者：王新宇 

作者单位：山东大学            【摘要】  目的 体外培养人胚胎神经干细胞并诱导其向多巴胺能神经元分化。方法 从临床引产的人胚胎（胎龄8 16周）海马组织中分离、培养人胚胎神经干细胞, 对其进行诱导分化。诱导剂采用来源于20周胎龄胚胎的纹状体的组织提取液。实验分为2组：对照组无诱导剂，培养基为撤除生长因子的基础培养基；实验组培养基中加入纹状体组织提取液50?μL/mL；于诱导分化的第7天终止诱导分化，采用标记TH的免疫荧光染色方法检测TH阳性细胞量，用RTPCR方法检测THmRNA的表达情况。结果 抗TH的免疫荧光染色结果为：对照组与实验组的TH阳性细胞率分别为(0.53±0.17)%和(7.38±0.84)%，两组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。RTPCR结果显示：对照组THmRNA表达不明显，实验组明显表达THmRNA，实验组与对照组的THmRNA表达差异亦有统计学意义（P＜0.05）。结论 纹状体组织提取液具有促进人胚胎神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用。

【关键词】  神经干细胞 人胚胎 多巴胺能神经元 分化 帕金森病

    WANG Xinyu1, LI Xingang1, ZHOU Lu1, BAO Xiufeng1, XIN Hua2

    (1. Department of Neurosurgery, Qilu Hospital of Shandong University, 2. Institute of Cytology,

    School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012,  China)

    Abstract: Objective  To culture human fetal neural stem cells in vitro, and then induce them to differentiate into dopaminergic neurons. Methods   Human fetal neural stem cells derived from the hippocampus were purified and induced by human fetal striatal extracts. The induced differentiational rate of dopaminergic neurons was detected by immunocytoflurescence and the expression of TH mRNA was determined by RTPCR. Results   The rate of TH+ cells of the experimental group was higher than that of the control group, and the expression of THmRNA was not obvious in the control group but was strong in the induced group. There were significant differences between the two groups. Conclusion   Human fetal striatal extracts can effectively induce human fetal NSCs to differentiate into dopaminergic neurons in vitro.

    Key words: Neural stem cells; Human embryo; Dopaminergic neuron; Differentiation; Parkinson′s disease    神经干细胞(neural stem cells,NSC)的研究为中枢神经系统疾病的治疗开辟了新的途径。帕金森病（Parkinson′s disease,PD）的主要病理变化是黑质多巴胺能神经元的进行性退变和缺失，致使纹状体内多巴胺水平异常降低。对该病预防和治疗的许多方案都不理想，诱导神经干细胞在体外定向分化为多巴胺能神经元以治疗PD已成为干细胞研究的热点。近期国内一些学者已成功从人胚胎海马组织中提取并培养出神经干细胞，为进一步的干细胞分化移植研究积累了宝贵的经验［1］。为探索可以高效诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，本实验采用人胚胎纹状体提取液对人胚胎海马神经干细胞向多巴胺能神经元分化进行诱导，报道如下。

    1  资料与方法

    1.1  组织来源  人胚胎，胎龄8 16周，由山东大学齐鲁医院妇产科提供。胚胎的获取经过患方及家属同意由医院处理。

    1.2  实验所需试剂及抗体  Neuralbasal即用型神经细胞液体培养基，B27神经细胞无血清培养添加剂（美国生命技术公司产品），重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），重组人表皮生长因子（EGF)英国Peprotech公司产品，AntiNestin polyclonal antibody(Chemicon公司产品)，即用型SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒（均为武汉博士德公司产品）。抗TH (tyrosin hydroxylase) 兔多克隆抗体（santa cruz 公司），人胚胎纹状体组织提取液（自备），FITC荧光二抗（santa cruz 公司产品），RTPCR所需引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

    TH引物序列为: 上游：5′TGT GCG CCA GGT GTC AGA3′。 下游：5′GGT GGT CCA AGT CCA GGT CA3′，扩增片段为129?bp。

    内参照：肌动蛋白（βactin）引物：上游：5′GCG GAT GTC CAC GTC ACA CT3′，下游：5′CCA CTG GCA TCG TGA TGG AC3′，扩增片段为428?bp。

    1.3  人胚胎海马神经干细胞的培养  取水囊引产的人胚胎（胎龄8 16周）海马组织（过程见图1），提取神经干细胞进行培养。NSC培养6?d后取出进行抗Nestin免疫细胞化学染色。

    1.4  人胚胎纹状体组织提取液的制备  取自胎龄20周的人胚胎，解剖暴露纹状体（过程见图2），取下并称重，约每1?g新鲜组织加入Neuralbasal溶液10?ml,在冰浴中用玻璃匀浆器进行匀浆处理，然后将匀浆液分装入若干个EP管中，在4?℃下低温离心4?000?r/min，离心20?min，吸取上清夜并用0.22?μm滤器抽滤后-20?℃保存。

    1.5  多巴胺能神经元的诱导  将分离纯化后的第3代人胚胎海马神经干细胞神经球按100个/mL的密度接种于24孔培养板中，板中预先放有涂好多聚赖氨酸的盖玻片，每孔中加入1?mL神经干细胞培养液，3?d后更换培养液为分化用条件培养液，进行分化实验。实验分为2组，对照组：基础培养基作为对照组；实验组：基础培养基+人胚胎纹状体组织提取液(50?μL/mL)；分化第7天取出细胞爬片进行抗TH免疫荧光化学染色，用RTPCR方法检测THmRNA的表达。

    1.6  统计学处理  采用SPSS for windows13.0统计软件包进行分析，应用成组设计的两样本均数比较的t检验法行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

2.1  神经干细胞的鉴定  培养的海马细胞经抗Nestin染色后，可见神经细胞球中多个细胞着色，呈Nestin＋（见图3），证明从人胚胎的脑组织中提取出了神经干细胞。

    2.2  诱导分化结果的数据统计  在激光扫描共聚焦显微镜下观察TH阳性细胞。每组随机取两个细胞爬片，每张爬片标本随机选取5个视野，分别计算不同视野内的TH阳性细胞百分率。对照组与实验组的TH阳性细胞率阳性率分别为（0.53±0.17）%和(7.38±0.84)%，两组数据比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

    2.3  半定量PCR检测结果  THmRNA在对照组中无明显表达，纹状体组织提取液诱导组NSC分化后THmRNA表达明显,两组的RTPCR平均相对系数分别为0.025±0.002和0.54±0.09，两组间平均相对系数的比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

    3  讨  论 

    定向分化调控是神经干细胞研究的核心问题。中枢神经系统含有儿茶酚胺能神经元(包括多巴胺能神经元、去甲肾上腺素能神经元等),也有胆碱能神经元、肽能神经元、5 羟色胺能神经元等。不同的神经元担负的功能各不相同。由于神经干细胞定向分化调控具有广阔的应用前景,所以为国内外神经科学界所瞩目。神经干细胞的分化方向受着其周围微环境条件变化的重要影响。微环境就是指能对NSC产生影响的周围结构成份，它包括附近的神经细胞、基质细胞和胞外基质等。纹状体中多巴胺递质减少是帕金森病的重要病理改变，反之这一变化也可能会促进更多的多巴胺能神经元再生。

    纹状体组织提取液的作用：纹状体组织中含有大量的胞外基质成分，胞外基质的各种成分通过调节粘着性和迁移能力，以及通过结合在胞外基质上的各种生长因子和细胞因子的作用来影响NSC的增殖和分化。研究细胞外基质的成分以及它们影响NSC的分子生物学机制，进一步应用于神经干细胞的诱导分化是当前干细胞研究中的热点。大量的NSC移植治疗PD的实验研究说明未分化的神经前体细胞受到移植部位的微环境的诱导。有关微环境信号的作用，主要通过将NSC与其他组织细胞共培养，或将由NSC进行扩增得到细胞球植入脑内后进行跟踪观察研究。Fricker等［2］将永生化细胞株HIB5（源自E16鼠海马前体细胞）植入到成年大鼠的皮层、胼胝体和纹状体的多个位点,利用形态学和免疫细胞化学方法观察HIB5分化，该研究结果显示三个部位仅纹状体支持供体细胞向神经元方向的分化,且靠近中线的室周纹状体区比偏外侧的纹状体区更支持向神经元和胶质细胞的分化。有的研究则是将细胞球注入成年脑组织某个脑区后观察,结果提示随注入的神经前体细胞迁移部位的不同而有不同分化方向。Nishino等［3］将取自E12鼠中脑的干细胞，移植到成年大鼠偏侧帕金森病模型(6OHDA单侧黑质病损)的双侧纹状体区，结果证实病损侧较健侧脑组织内神经前体细胞更易分化为TH+神经元，即DA已被耗竭的纹状体区提供了更适于中脑干细胞分化为成熟DA能神经元的内环境。国内学者将骨髓间充质干细胞移植到单侧纹状体区DA耗竭的大鼠模型的纹状体中。检测发现大约50％ 55%细胞向多巴胺能神经元方向分化。说明骨髓间充质干细胞移植到大鼠纹状体区后能够存活、迁移、并自发向DA细胞分化［4］。

    本实验用人胚胎纹状体组织提取液对人胚胎神经干细胞进行定向诱导并使(7.38±0.84)%的细胞分化成为多巴胺能神经元。实验结果一方面说明分离培养的神经干细胞具有多向分化潜能，另一方面也说明纹状体中的某些成分有利于NSC向多巴胺能神经元分化。近年有研究表明［57］，发育中的纹状体细胞内含有维生素结合蛋白Ⅰ(cellular retinol binding protein, CRBP Ⅰ)和视黄醛(retinaldehyde)能合成维甲酸（retinoic acid, RA）。RA是一种很强的分化诱导剂［8］，也是胚胎发育不可缺少的形态发生素（morphogen）, 参与了中枢神经系统发育的基本过程［9］。RA与细胞核内的RA受体结合后作用于RA反应元件(retinoic acid response element, RARE），启动神经元特异基因Wnt、MASH1等的表达，引起细胞分化过程［1011］。Sortwell等［12］实验发现纹状体内含有星形胶质细胞分泌的多种神经营养因子和神经诱向因子，包括脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子（GDNF）和神经营养素4/5（NF4/5）,以及细胞粘附分子。Bernreuther等学者的实验也证明纹状体中含有的GDNF等因子及信号蛋白具有对多巴胺能神经元的趋化及诱导作用［1314］。

    本研究采用人胚胎纹状体组织提取液诱导干细胞分化，TH阳性细胞数明显增加应该是上述提到的各种化学成分和细胞因子综合作用的结果。具体确定哪些物质在诱导分化中有着更为重要的作用则有待今后进一步研究。

【参考文献】  ［1］ 孙鹏,邹春林,董恺,等.人胚胎海马神经干细胞体外培养及分化研究［J］.中华神经外科杂志,2005,21(7):393395.

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