苯妥英钠、苯巴比妥钠诱导建立难治性癫疒间动物模型

作者：赵哲峰,蒋传路

作者单位：哈尔滨医科大学附属第二临床医学院神经外科， 黑龙江 哈尔滨 150086          【摘要】  目的 探索性应用苯妥英钠 （PHT）、苯巴比妥钠 （PB） 诱导建立难治性癫疒间动物模型，并研究其多药耐药机制。 方法 将60只大鼠随机分为实验组50只和对照组10只；实验组给予亚抽搐剂量戊四氮腹腔注射，其中45只大鼠确定点燃，将其随机分为给药组35只和未给药组10只。给药组应用较大剂量PHT、PB腹腔注射，其间注射小剂量戊四氮，根据Racine行为分级以及脑电图改变，从中筛选出耐PHT和PB的难治性癫疒间动物模型。应用免疫组化法观察比较P糖蛋白 （Pgp） 在各组脑组织中的表达。 结果 12只大鼠制成难治性癫疒间动物模型 （耐药组），11只为药物有效组，12只死亡。耐药组大鼠脑组织Pgp表达较对照组、未给药组和药物有效组增强，差异有高度统计学意义 （P < 0.01）。 结论 应用较大剂量PHT和PB诱导点燃大鼠制作难治性癫疒间的动物模型，方法可行。该模型可以用于研究难治性癫疒间脑内Pgp的表达。Pgp的高表达与难治性癫疒间发生密切相关。

【关键词】  癫疒间 模型 动物 抗惊厥药 P糖蛋白

    The establishment of animal model of refractory epilepsy induced

    by phenytoin and phenobarbital sodium

    ZHAO Zhefeng, JIANG Chuanlu, LI Yongli, et al

    Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China

    Abstract: Objective To establish an animal model of refractory epilepsy by peritoneal injection of phenytoin sodium (PHT) and phenobarbital sodium (PB), and investigate into their multidrug resistance mechanism in kindling rats. Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into two experimental groups (50 rats) and control group (10 rats). The experimental group rats were kindled by repeated peritoneal injection of sub-convulsive dose of pentylenetetrazol (PTZ). The 45 kindled rats were randomly divided into treatment group (35 rats) and non-treatment group (10 rats). Treatment group rats were injected with large doses of PHT and PB. The PHT-PB resistant rats were selected from treatment group by Racine scale and the EEG change after peritoneal injection of low dose of PTZ. P-glycoprotein (Pgp) expressions in the brain tissues were compared by immunohistochemical method. Results Twelve rats were selected as the animal model of refractory epilepsy (resistant group), 11 were classified to drug-effective group, and 12 died. The expression of PGP in the brain tissue was significantly higher in the PHT-PB resistant rats than in control group, non-treatment group and drug-effective group (P<0.01). Conclusion It is feasible to make the animal model of refractory epilepsy by peritoneal injection of large dose of PHT and PB in kindled rats. The model can be used to investigate the expression of Pgp in the brain of refractory epilepsy rats. The high expression of Pgp has an intimate relation with genesis of refractory epilepsy.

    Key words: epilepsy; models, animal; anticonvulsants; P-glycoprotein 近年来国内外文献报道，难治性癫疒间动物模型可通过电刺激杏仁核点燃后，应用一线抗癫疒间药物 （AED） 进行动物筛选建立[1，2]。本研究模拟人类难治性癫疒间可能的发生机制，应用较大剂量一线抗癫疒间药物苯妥英钠 （PHT）、苯巴比妥钠 （PB） 进行诱导，从另外一种途径探索建立动物模型，同时初步研究其多药耐药机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 动物：60只6~8周体质量200~250 g雄性Wistar大鼠 （哈尔滨医科大学第二附属医院动物实验中心提供），分隔喂养，随机抽取。器材与试剂：戊四氮 （美国Sigma公司），注射用PHT、PB，大鼠头部固定仪，动态脑电记录仪 （美国Crass公司），JSB-1单克隆抗体 （Zymed公司），PV-6002二步法免疫组化检测试剂 （北京中杉公司），DAB显色剂 （武汉博士德公司）。

    1.2 方法

    1.2.1 点燃： 60只大鼠随机分为2组：实验组50只和对照组10只。固态戊四氮溶于生理盐水中配制成浓度为1%的溶液，起始剂量40 mg/kg，对实验组大鼠予以分批腹腔注射，隔日上午9∶00注射1次，直至出现Racine Ⅳ-Ⅴ行为，连续出现6~8次以上发作，即确定点燃 （Kindling）[3]。对照组大鼠给予等剂量生理盐水注射，方法同上。

    1.2.2 动物筛选： 45只大鼠确定点燃，24 h后将其随机分为2组：给药组35只和未给药组10只。给药组腹腔注射PHT 225 mg/kg，同步取血测定血药浓度及观察动物出现的不良反应。每天上午9∶00给药1次，持续3周。最后一次给药24 h后应用小剂量戊四氮10 mg/kg进行动物筛选 （根据预实验结果，该剂量对于正常大鼠不会引起癫疒间发作，而只对点燃鼠和点燃后应用AED治疗无效的大鼠有刺激癫疒间发作的作用），根据Racine分级作为行为学评定以及脑电图出现棘波或棘慢综合波放电，筛选出耐PHT大鼠[4]，予以保留；其余归为药物有效组。耐PHT大鼠腹腔注射PB 60 mg/kg，重复上述注射步骤。对照组、未给药组和药物有效组大鼠同步注射同体积的生理盐水。耐PHT大鼠PB注射完毕后，进行动物筛选，方法同前，最后筛选出耐PHT和PB的难治性癫疒间大鼠。

    1.2.3 免疫组化： 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，10%多聚甲醛心腔灌注，断头取脑，10%多聚甲醛保存24 h后，制成石蜡切片。脱蜡；阻断内源性过氧化物酶，加3% H2O2作用15 min，蒸馏水冲洗，PBS涮洗，抗原恢复，正常山羊血清封闭30 min，滴加一抗，稀释度为1∶50，4 ℃过夜，PBS冲洗，5 min × 3次，滴加相应的二抗，室温作用30 min；DAB显色；流水去DAB，苏木素复染1~3 min，酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。观察颞叶、顶叶、海马-杏仁核区域P糖蛋白 （Pgp） 的表达。对Pgp表达阳性的细胞应用微格技术进行计数。

  1.2.4 统计学分析： 应用医学统计软件，所有数值以均数 ± 标准差 （x ± s） 表示，进行Dunnett-t检验。

    2 结 果

    50只实验大鼠中点燃48只 （点燃率96%），其中3只大鼠在点燃过程中抽搐死亡；剩下45只大鼠随机分为给药组35只和未给药组10只。应用PHT 3周后，给药组中16只通过筛选归为耐药组，11只归为药物有效组，另8只在第1次筛选过程中抽搐死亡。其后进行第2次筛选，16只耐药组中2只大鼠在第2次筛选过程中抽搐死亡，2只在通过第2次筛选1 d后死亡，最后12只大鼠通过筛选制成耐PHT和PB的难治性癫疒间动物模型 （耐药组）。

    通过免疫组化法可以观察到，耐药组大鼠脑组织中Pgp阳性表达细胞数显著高于对照组、未给药组和药物有效组 （P < 0.01）。在耐药组大鼠脑组织颞叶、顶叶皮质以及海马杏仁核区域有大量的Pgp阳性表达细胞；而对照组、未给药组和药物有效组中仅有少量或无Pgp阳性表达细胞 （表1；图1～4）。

    3 讨 论

    难治性癫疒间可以由多种因素引起，包括遗传基因多态现象、某些先天性疾病、药物脑内浓度的变化以及抗癫疒间药物作用机制的局限性等[5]。其中关于AED的影响研究发现：不规律使用AED或AED剂量超过最大有效治疗剂量时，均可加重癫疒间发作，并可能导致癫疒间病人明显耐药而成为难治性癫疒间[6，7]。难治性癫疒间动物模型建立的国际标准包括以下条件[8]：①一线AED不能控制其癫疒间发作。②模型发作时有脑部异常放电，可从电生理角度评价药物疗效。③ 发作类型应与临床类型相似，即复杂部分性发作继发全身性发作。④能够长期存活，可进行抗癫疒间药物的长期研究。按照以上标准，本实验模拟人类难治性癫疒间形成的可能原因，应用亚抽搐剂量戊四氮建立慢性点燃动物模型，动物表现为复杂部分性发作继发全身性发作；然后给予较大剂量的一线AED进行诱导，最后制成耐PHT和PB的难治性癫疒间动物模型。在预实验中，我们应用3组不同浓度 （75、150、225 mg/kg） PHT和PB 60 mg/kg进行诱导，结果显示：75 mg/kg组通过筛选的模型成功率为21.4%，150 mg/kg组为42.7%，225 mg/kg组为57.1%。根据成功率可以看出，随着应用AED的剂量增加，耐药大鼠数量显著增加。这提示：①应用大剂量AED可能导致癫疒间多药耐药的发生；②应用PHT 225 mg/kg和PB 60 mg/kg进行诱导，可以明显提高该模型的成功率。因此本实验应用此浓度进行诱导。本实验模型动物病死率和感染率均较低，对于器材的要求不高，可以长期存活，符合难治性癫疒间动物模型建立的国际标准，可以作为其研究模型。

    近年来，国内外许多学者在对难治性癫疒间进行大量的临床和基础动物实验研究后，认为难治性癫疒间病人及实验动物脑组织中Pgp的过量表达，是导致脑组织AED浓度下降，引起耐药的重要原因[9，10]。Pgp是细胞膜本身所固有的一类跨膜磷酸糖蛋白，由多药耐药基因 （MDR） 编码。人类的MDR基因有两个亚型 （MDR1、MDR2），啮齿类动物有三种亚型 （MDR1、MDR2、MDR）。而与多药耐药性有关的Pgp在人类由MDR1基因编码；在啮齿类动物由MDR1a/MDR1b基因编码，分子量为170 u，由1 280个氨基酸残基组成，具有2个相同的部分，各含1个6次的跨膜区和1个细胞内核苷酸结合区，其N段高度糖基化[11]。MDR存在于正常人类和哺乳动物有分泌功能的组织和屏障结构中，如肝管的腔面、肾脏远曲小管、血脑屏障等，具有广泛的底物特异性，能与多种结构不同的被动扩散入细胞内的药物和有毒性物质结合，依靠ATP能量转化将到达或进入细胞内的药物及细胞毒性物质泵出，使得Pgp在保护正常组织不受毒素损害的同时，将真正作用于靶点的药物浓度降低[12]。本实验通过免疫组化法，发现耐药组大鼠脑组织Pgp阳性表达较对照组、未给药组和药物有效组显著增强。耐药大鼠脑内的Pgp阳性表达细胞数远远高于其他3组，与大鼠耐药呈高度的一致性。与Volk等[13]应用电刺激杏仁核点燃制作的耐药癫疒间大鼠和药物敏感大鼠之间脑组织Pgp的阳性表达率比较，结果相似，再次表明Pgp的高表达与难治性癫疒间动物耐药的发生密切相关；也证实本实验动物模型具有耐药性的特征，可以作为研究Pgp在难治性癫疒间脑组织表达规律的实验模型。

    越来越多的证据表明：Pgp的过量表达与难治性癫疒间多药耐药的发生密切相关；但是对于Pgp在脑组织中的具体表达部位，及其在不同部位的药物排出机制等仍不清楚，还需进一步研究。

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