慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子脂肪干细胞脑移植的研究

     作者：孙兵    作者单位：200040复旦大学附属华山医院神经外科

     【摘要】  目的 探讨慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的脂肪干细胞（ADSCs）脑移植的应用价值。方法 分离、培养SD大鼠ADSCs，用高滴度慢病毒将GDNF转染入细胞，观察细胞形态及用免疫荧光法观察神经标志物的表达。用立体定向仪将转染ADSCs植入大鼠的纹状体，移植1个月和2个月后，用荧光显微镜观察ADSCs脑内存活和分布状况，用Western blot检测GDNF蛋白的表达，并与正常对照组比较。结果 慢病毒转染ADSCs形态类似神经元，胞浆神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性。ADSCs移植到大鼠纹状体1个月后，移植部位有大量存活的ADSCs，2个月后，仍有部分存活细胞，并向远处移行，GDNF蛋白水平显著高于正常对照组（均P<0.01）。结论 慢病毒转染GDNF的ADSCs可为干细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供新的供体。

     【关键词】  慢病 脂肪干细胞 移植

     Study of adiposederived stromal cells transfected glial cellderived neurotrophic factor by lentivirus in cerebral transplantation  SUN Bing, GU Shixin，WANG Ke, et al.  Department of Neurosurgery, Huashan Hospital of Fudan University,Shanghai 200040, China

     Abstract：Objective  To investigate the applied value of adiposederived stromal cells（ADSCs） transfected glial cellderived neurotrophic factor（GDNF）by lentivirus in cerebral transplantation.Methods  Primarily isolated and cultured, the rat ADSCs were transfected GDNF by hightiter lentivirus. Then, configuration of cells and expression of neuronspecific enolase (NSE) were observed. By stereotaxic frame, transfected ADSCs were intrastriatally transplanted.1month and 2month after transplantation, survival and migration of marked cells were detected. GDNF expression, verified by Western blot, was compared with control group.Results  ADSCs, transfected by lentivirus, can differentiate into neuronlike cells and express NSE in cytolymph. 1 month after transplantation, the majority of cells survived in transplanting area. 2 month later, part of transplanted cells still survived and migrated far from the transplanting area. In addition, the level of GDNF protein in the brain tissue was significantly higher compared with control group (all P<0.01). Conclusion  ADSCs transfected GDNF by lentivirus is an alternative to treating the central nerve system disease by stem cells transplantation.

     Key words：lentivirus;adiposederived stromal cells;transplantation

     脂肪干细胞（ADSCs）具有取材简便、增殖迅速和神经分化潜能等特性，是目前神经系统移植理想的载体细胞之一。本研究采用慢病毒制备稳定表达胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的ADSCs，并对其生物学特性和脑内移植的状况进行观察。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  雄性SD大鼠16只, 6～8周龄，质量200～250 g, 随机分成GDNF组和正常对照组（各8只）。

    1.1.2  试剂与仪器  DMEM培养基（GIBCO/BRL）；胎牛血清（GIBCO/BRL）；重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF,Sigma）；谷氨酰胺（GIBCO/BRL）；鼠抗GDNF蛋白单克隆抗体（1∶1000，晶美公司）；抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体（1∶100，Antibody Diagnostics,CA）；第二抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔IgG, ABC试剂盒（华美公司）;立体定向架（Narishiga公司）；慢病毒系统 (美国Louisiana健康研究中心Reiser教授惠赠)。

    1.2  方法

    1.2.1  ADSCs分离和培养［1］  SD大鼠处死后,取出腹膜后脂肪组织并剪碎，缓冲液冲洗，0.075%的胶原酶37℃消化30 min，离心去上清，160 mmol/L的NH4Cl 裂解红细胞后再次离心去上清；筛网过滤离心，DMEM培养基重悬细胞。细胞种植密度为8×103个/cm2，24 h后换培养液，细胞生长至融合时传代；用0.25%的胰蛋白酶1 mmol/L EDTA 37 ℃消化细胞3～4 min,离心，细胞稀释2～3倍传至培养瓶中培养，2～3 d换半量培养液, 取第4代细胞为实验对象，随机分为GDNF组和正常对照组。

    1.2.2  转染  含有GDNF的三质粒慢病毒系统由本课题组构建［2］，GDNF组转染目的基因为GDNF，对照组目的基因为LacZ。产生慢病毒是将3个质粒瞬时共转染293T细胞，12～15 h （培养液中氯喹浓度为25 μmol/L）后更换培养液，转染 60～ 65  h后收集病毒上清液， 15℃，25000 r/min, 离心 2 h浓缩病毒,  最终病毒的滴度为 5.8×108 U/ml。转染前，将ADSCs接种于6孔板，每孔加入0.5 ml完全培养基，细胞接种密度为 1×105/μl，细胞表面滴加感染复数（MOI）为10 的病毒，同时加入8 μg/ml 凝聚胺(Polybrene)， 37 °C 孵育20 h后更换新鲜培养基， 收集细胞，用含有bFGF（20 ng/ml）的完全培养基悬浮扩增。同样方法，用慢病毒将LacZ转导入正常对照组细胞，并进行 Xgal 染色，37℃过夜， 检测LacZ的表达，观察转染效率。

    1.2.3  转染细胞培养  将转染GDNF的ADSCs接种于35 mm培养皿中，待细胞达到70%的融合时, 加入诱导分化培养基，即N5培养基，并加入全反式维甲酸(终浓度为0.5 μmol/L)。每3 d半量换液，培养10～14 d后，相差显微镜下观察细胞形态的变化; 用免疫荧光方法检测NSE的表达,细胞浆中出现强绿色荧光为阳性。

    1.2.4  转染细胞脑移植及观察  为追踪细胞，移植前24 h，培养基中加入1 μg/ml的荧光染料（Hochest33258）标记ADSCs 24 h，细胞密度为5×105 /μl。将SD大鼠麻醉后固定在立体定向架上，常规消毒，头皮切口、钻孔，将4 μl细胞悬液匀速多点注入SD大鼠右侧纹状体内(坐标：AP1 mm,ML 2.5 mm和3.5 mm，DV 4 mm和6 mm)，注射完毕后留针5 min。移植1个月、2个月时，分别处死2只大鼠，取脑, 用4%的多聚甲醛灌注固定，-70℃冰箱保存，脑组织冰冻切片，厚度为20 μm，荧光显微镜下观察。正常对照组细胞同样植入该组大鼠的右侧纹状体中。

    1.2.5  GDNF表达检测  移植1个月、2个月时，用Western blot 法检测GDNF在脑内的表达。分别处死GDNF组和正常对照组大鼠各6只，取注射点附近的100 mg脑组织，迅速 放入有1 ml RIPA 和10 ml PMSF的匀浆器中，冰浴10 min,充分匀浆. 匀浆液4 ℃，10000 r/min ,离心30 min, 去除细胞残骸, 收集上清液。 取等量样品进行SDSPAGE电泳并转到硝酸纤维素膜上，用含5% 脱脂奶粉和 0.05% Tween20 PBS封闭过夜，加入一抗 1∶1000 兔抗GDNF， 二抗1∶5000山羊抗兔抗体, 洗涤后用底物化学发光（ECL）显影，用TotalLab 2.0 软件分析结果，比较GDNF组和正常对照组GDNF蛋白表达的差异。

    2  结  果

    2.1  ADSCs的培养  原代培养时，少量细胞贴壁，在低密度的状态下长成大的扁平的单层细胞，增殖速度逐渐变快，并出现脂滴（图1），传代培养后，细胞体变得细长，形态类似成纤维细胞（图2）。第4代细胞增殖速度快，慢病毒瞬时转染率达100%(图3)。ADSCs在诱导分化2周后，形态向神经元样细胞变化，细胞浆NSE表达阳性（图4）。

    图1  原代培养的ADSCs：扁平状，富含脂滴（倒置显微镜×100）图2传代的ADSCs：胞体细长，类似成纤维细胞（倒置显微镜×100）图3慢病毒100%瞬转ADSCs （倒置显微镜,×200）图4 转染的ADSCs NSE表达阳性 （免疫荧光染色×200）

    2.2  ADSCs在脑内分布及GDNF的表达  荧光染料标记的ADSCs移植1个月后，荧光显微镜下发现大鼠纹状体移植部位有大量存活ADSCs，主要局限于针道内（图5）；2个月后，仍有部分存活细胞，并向远处移行（图6）。移植后2个月大鼠注射侧纹状体GDNF蛋白水平较移植后1个月有下降（P<0.05），但均显著高于正常对照组（P<0.01）（图7）。

    图5  ADSCs脑内移植后1个月,移植区域有大量存活细胞   （荧光显微镜×100）  图6  ADSCs脑内移植后2个月，仍有部分细胞存活，且向远处迁移（荧光显微镜×100）

    图7  移植后，GDNF蛋白在局部脑组织中的表达; 移植后1个月、2个月GDNF有显著的表达（*均P<0.01）;移植后2个月GDNF表达有下降,与移植1个月比较△P<0.053  讨  论

    以干细胞为载体细胞的基因治疗仍然是研究帕金森病（PD）、Alzheimer病(AD)、神经创伤等神经系统疾病治疗的主要方法之一［3］。由于伦理学、取材困难等因素，神经干细胞、胚胎干细胞等干细胞的应用受到了一定的限制，而ADSCs具有：（1）可以自体取材，且取材方便；（2）增殖速度快，容易转染，存活率高；（3）神经系统内移植无排斥反应等优点［4］，因此，ADSCs是神经系统自体移植理想的载体细胞［5］。同时，ADSCs的神经方向分化能力也受到广泛关注，Safford 等［6］研究鼠源性ADSCs时发现，ADSCs在形态上容易诱导成神经元样细胞，能显著表达神经细胞标志物，分化的细胞形态和相应标志物表达阳性都证明了这种分化的细胞是神经元，分化来源的神经球也被证实具有一定的神经功能［7］。本研究中，也发现ADSCs形态类似神经元,胞浆NSE表达阳性.是一种易于转染的载体细胞，有良好的神经分化潜能，移植入脑组织1个月后，移植部位有大量存活的ADSCs,并能够长期存活，向远处迁徙，移植后2个月，携带的目的基因表达阳性。

    如何使目的基因能在载体细胞中长期高效地表达是基因治疗的关键环节之一，为获得高转染率，目前多采用病毒载体，如逆转录病毒载体,腺病毒载体(AdV)和腺相关病毒载体(AAV)，由于 MoMLV介导的转染目的基因表达时间短，逆转录病毒载体不适合神经系统疾病的基因治疗，而AdV 不良反应太强， AAV载体容量太小，均不是理想的载体。本实验采用的载体是三质粒慢病毒系统, 是由Reiser教授构建［8］，包括pNL LacZ /CMV 质粒, 编码VSVG 蛋白的 pLTRG载体，与pCHelp质粒类似的 pCD/NLBH 辅助质粒, 其不同点是包装信号的改良，即HIV1 NL43 前病毒DNA的Gag 编码区5′结合点和起始点之间的747～787核苷酸被删除。由于慢病毒的改进, 被认为是可介导目的基因在中枢神经系统中长期表达的载体。同时，其复制过程与细胞的分裂周期无关，可感染非增殖细胞，因此是将目的基因导入载体细胞的理想工具［9］，本实验GDNF组，慢病毒对ADSCs的转染率达100％，脑组织GDNF蛋白水平显著高于正常对照组(均P<0.01),提示目的基因GDNF在转染细胞中和脑内都有长期稳定的表达, GDNF的持续表达对多巴胺神经元等有显著的保护作用［10］。

    由此可见，慢病毒基因工程化的ADSCs是神经系统疾病移植治疗的有效载体细胞，为PD、AD、神经创伤等神经系统疾病治疗的研究提供了新的途径。

【参考文献】  ［1］Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multileage cells from human adipose tissue: Implications for cellbased therapies［J］. Tissue Engineering, 2001,7：211.

［2］Sun B, Hui GZ, Guo LH, et al. Dopaminergic trophism after intrastriatal injection of lentivirustransferred GDNF in Parkinson rat model［J］. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao，2003,35: 937.

［3］张克忠,蒋雨平,赵延欣,等. 骨髓基质干细胞对lactacystin帕金森病大鼠的神经保护作用［ J ］. 临床神经病学杂志, 2006, 19:290.

［4］Suga H, Shigeura T, Matsumoto D, et al. Rapid expansion of human adiposederived stromal cells preserving multipotency［J］. Cytotherapy. 2007,9:738.

［5］Kokai LE, Rubin JP, Marra KG. The potential of adiposederived adult stem cells as a source of neuronal progenitor cells［J］. Plast Reconstr Surg. 2005,116:1453.

［6］Safford KM, Safford SD, Gimble JM, et al. Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adiposederived adult stromal cells［J］. Exp Neurol. 2004,187:319.

［7］Nagase T, Matsumoto D, Nagase M, et al. Neurospheres from human adipose tissue transplanted into cultured mouse embryos can contribute to craniofacial morphogenesis: a preliminary report［J］. J Craniofac Surg，2007,18:49.

［8］Reiser J. Transduction of nondivding cells using pseudotyped defective hightiter HIV type1 particles［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 93:15266.

［9］Cockrell AS, Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors［J］. Mol Biotechnol. 2007,36:184.

［10］叶民,陈生弟. 骨髓基质干细胞诱导分化及治疗潜能的研究进展［J］. 临床神经病学杂志, 2004,17:311.